人17-酮类固醇(17-KS)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人17-酮类固醇(17-KS)ELISA KIT是采用双抗体一步夹心法检测样品中人17-酮类固醇(17-KS)的水平。

实验原理：往预先包被人17-酮类固醇(17-KS)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人17-酮类固醇(17-KS)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人17-酮类固醇(17-KS)ELISA KIT

17-酮类固醇主要是肾上腺及睾丸雄激素的代谢产物，男性2/3来自肾上腺，1/3来自睾丸，女性则主要来自肾上腺。尿17-酮类固醇(17-KS)可反应肾上腺皮质激素、糖皮质激素及性腺分泌的总的情况，对于评价肾上腺分泌雄激素的功能具有较大的价值。

样品收集、处理及保存方法:

1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

操作步骤:

1.从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.待测样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；

4.随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于均相免疫法检测肾上腺皮髓质尿代谢物在肾上腺疾病诊断中的价值研究

通过对17-酮类固醇（17-ketosteroids,17-KS）、17-羟皮质类固醇（17-hydroxycorticosteroids,17-OHCS）、香草扁桃酸（vanillymandelic acid,VMA）等肾上腺相关指标进行均相酶免疫方法试剂盒性能验证和分析这几个指标在肾上腺疾病中的改变。来探讨①17-KS、17-OHCS、VMA这几项指标是否对肾上腺疾病具有鉴别诊断价值。②肾上腺皮髓质尿代谢物各项指标在不同类型肾上腺疾病中表达的一般规律及辅助诊断价值。③尿香草扁桃酸和尿肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺等在嗜铬细胞瘤患者尿液中代谢的一般规律及评估其作为嗜铬细胞瘤辅助诊断指标的应用价值。

方法:（1）方法溯源:依据相关的文件规定,对17-KS、17-OHCS、VMA的均相酶免疫检测试剂盒做正确度、精密度、线性范围和参考区间等实验室性能验证。

（2）入选标本和和分组:收集肾上腺相关疾病患者的24小时尿液样本共214例作为研究对象,其中男性93例,女性121例;最小年龄15岁,年龄89岁,平均年龄48岁。按具体疾病种类将肾上腺疾病患者分为嗜铬细胞瘤组35例、库欣综合征组36例、原发性醛固酮增多症组58例、无功能腺瘤组37例、其它疾病组48例（其中包括肾上腺皮质腺瘤20例、肾上腺神经节细胞瘤5例、肾上腺囊肿9例、肾上腺神经鞘瘤3例等）。检测尿液样本的17-KS、17-OHCS、VMA等指标,按照肾上腺不同疾病进行统计分析。

（3）214例研究对象分为嗜铬细胞瘤组和其它肾上腺疾病两组,收集尿液样本检测的E、NE、DA指标的含量,联合VMA指标,分析这四个指标在嗜铬细胞瘤中的联合诊断效能。

结果:（1）性能验证实验结果:正确度实验显示:不同于本次实验校准所用批号的17-KS和VMA的5个水平校准品,偏倚均小于1/2Tea,符合验证标准。精密度实验显示:17-KS、17-OHCS和VMA低值和高值样本的批内和总精密度值小于厂家声称的值,符合精密度的验证标准;线性实验显示:17-KS、17-OHCS、VMA试剂的线性均为临床可接受的一阶线性,提示线性范围可靠;参考区间验证实验显示:20例表观正常人尿液中17-KS、17-OHCS和VMA的水平均在厂家制定的正常参考区间范围内。试剂盒性能验证符合各项要求。

（2）17-KS、17-OHCS、VMA对肾上腺疾病的诊断价值:酸性尿和中性尿中17-KS、17-OHCS和VMA的水平间有统计学差异,17-KS水平在原发醛固酮增多症组的中位数为6.52mg/24h,17-KS在肾上腺各个疾病组的水平差异显著（P<0.01）;17-OHCS水平在库欣综合症的中位数为5.36mg/24h,17-OHCS在肾上腺疾病的各个组的水平差异显著（P<0.01）;VMA水平在嗜铬细胞瘤组的中位数水平为21.05mg/24h,在肾上腺疾病的各个组的水平差异显著（P<0.01）。

（3）24小时尿VMA、E、NE、DA含量检测在嗜铬细胞瘤临床诊断中应用价值的比较研究:嗜铬细胞瘤组尿VMA和尿E、NE、DA水平显著高于其它肾上腺疾病组（P<0.05）。VMA在嗜铬细胞瘤诊断中的ROC曲线下面积为0.857,灵敏度为78.9%,特异性为92.6%,显著优于E、NE、DA这三个指标的诊断效能,与E+DA+VMA联合检测的诊断效能无统计学差异。

参考文献

[1]Survival outcomes following adrenalectomy for isolated metastases to the adrenal gland[J].Jason Ramsingh,Patrick O’Dwyer,Carol Watson.European Journal of Surgical Oncology.2019

[2]Targeting human urinary metabolome by LC–MS/MS:a review[J].Jose Rodríguez-Morató,óscar J Pozo,Josep Marcos.Bioanalysis.2018(0)

[3]Accuracy of recommended sampling and assay methods for the determination of plasma-free and urinary fractionated metanephrines in the diagnosis of pheochromocytoma and paraganglioma:a systematic review[J].Roland D?rr,Matthias Kuhn,Christoph Bode,Stefan R.Bornstein,Karel Pacak,Jacques W.M.Lenders,Graeme Eisenhofer.Endocrine.2017(3)

[4]Identification of genes and pathways associated with pancreatic ductaladenocarcinoma by bioinformatics analyses[J].Jin Long,Zhongbo Zhang,Zhe Liu,Yuanhong Xu,Chunlin Ge.Oncology Letters.2016(2)

[5]张丽娜.均相免疫法检测肾上腺皮髓质尿代谢物在肾上腺疾病诊断中的价值[D].中国人民解放军医学院,2019.