人末端补体复合物C5B-9(TCC C5B-9)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人末端补体复合物C5B-9(TCC C5B-9)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法检测样本中末端补体复合物C5B-9(TCC C5B-9)的含量。

实验原理：往预先包被人末端补体复合物C5b-9(TCC C5b-9)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人末端补体复合物C5b-9(TCC C5b-9)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人末端补体复合物C5B-9(TCC C5B-9)ELISA试剂盒

标本要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作流程

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于超声分子影像显像胰岛移植IBMIR研究

通过制备靶向结合活化血小板的靶向超声造影剂,建立体内外IBMIR模型,采用超声造影及其强度定量分析软件评价靶向超声造影剂显示胰岛移植IBMIR的能力和效果,实现胰岛移植IBMIR的超声分子成像特异性显像。

方法：一、血栓靶向脂质超声造影剂的制备与鉴定首先合成荧光标记的能与血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受体特异性结合的KGDS—棕榈酸化合物（FITC-KGDS-Palm）。采用“超声匀化+高速机械剪切”法,以FITC-KGDS-Palm为主要原料之一,制备靶向脂质超声造影剂。显微镜观察靶向微泡的形态及分布；马尔文颗粒计数仪检测微泡大小、浓度及分布；荧光显微镜观察KGDS多肽与微泡结合情况；流式细胞仪评价多肽与微泡的结合效率；观察靶向微泡在体内外的稳定性；采用体内外血栓模型,检测靶向微泡与血栓特异性结合的能力。

二、体外IBMIR模型的建立将500 IEQ和1000 IEQ新生猪胰岛分别与实验组人的7ml新鲜全血混合加入肝素化的管道,使Loops管内新鲜血液中肝素的最终浓度分别为0.001mg/ml、0.01 mg/ml、0.02mg/ml。Loops管固定于钟摆式无级调节温控摇床中摇摆5分钟、10分钟、60分钟,模拟血液在体内血管的流动。空白组健康人新鲜全血抽出后立即作检测,对照组健康人新鲜全血7ml+100μl培养液,摇摆60min。检测血液中BR（血常规）、C3a（人补体片段）、C5b-9（人末端补体复合物）、ATA（凝血酶抗凝血酶复合物）、β-TG（血小板球蛋白）等的变化,称重凝血块的重量并对其行病理学检测。

三、体外IBMIR的超声分子成像体外IBMIR模型（7ml新鲜全血+1000IEQ新生猪胰岛）超声分子成像实验分为三组,均重复3次：A组为对照组,不加造影剂；B组为普通超声造影剂组；C组为靶向超声造影剂组。将上述各组Loops管道固定于摇床摇杆上,并浸于37℃的水浴槽中。采用超声造影模式实时观察Loops管内的回声,记录超声发现血栓出现的时间,并采用Line成像模式存储在硬盘,脱机分析。实验开始后10min、30min、60min,分别将Loops管内血液经70μm过滤网过滤,其中过滤液行实验室凝血系统（ATA、D-dimer）、补体系统（C3a、C5b-9）及胰岛素含量检测,血栓部分行病理学检测。

结果：一、血栓靶向超声造影剂的制备与鉴定KGDS-TUCA靶向超声造影剂呈淡黄色混悬液,微泡浓度约为1.5×109/ml,平均粒径为1.5±0.2μm,98%微泡小于5μm。荧光显微镜显示靶向超声造影剂表面呈明亮的绿色荧光；流式细胞仪检测KGDS结合效率为90.04%；体外4℃保存48h,微泡浓度及粒径无显著性改变；体内团注靶向超声造影剂肝脏平均灰阶值达109.98±18.01,持续时间长约15分钟；体外靶向及其拮抗实验,证实靶向超声造影剂与血栓特异性结合；体内下腔静脉夹闭法建立血栓模型,采用靶向超声造影剂可以增强下腔静脉内血栓。

二、体外IBMIR模型的建立Tubing Loops内肝素浓度为0.001mg/ml时对新鲜全血的正常生理功能影响最小,可以长时间模拟体内血液生理功能不变。血液样本加入新生猪胰岛以后,1000IEQ实验组于10min开始出现了血凝块,随时间的延长,凝血块逐渐增大。Tubing Loops管中血液的血小板数量随时间延长而减少,β-TG、TAT显著增加；血浆中C3a、C5b-9的增加；淋巴细胞、单核细胞被大量消耗；血凝块病理学检测显示,胰岛细胞周围被血栓包围,其周边及血栓内均可见中性白细胞浸润,胰岛移植物表面包膜被破坏,出现裂解征象。

参考文献

[1]Role of Activated Protein C on Wound Healing Process in Left Colonic Anastomoses in the Presence of Intra-abdominal Sepsis Induced by Cecal Ligation and Puncture:An Experimental Study in the Rat[J].Zafer Teke,Suzan Sacar,Cigdem Yenisey,A.Ozgur Atalay,Tulay Kavak,Ergun Erdem.World Journal of Surgery.2008(11)

[2]Long-Term Survival and Function of Intraportal Porcine and Human Islet Xenografts in Nondiabetic Nude Mice[J].B.Y.Xu,Y.Yu,I.H.Al-Abdullah,F.Kandeel,B.Hering,J.R.Wright.Transplantation Proceedings.2008(2)

[3]Activated protein C prevents deleterious effects of remote reperfusion injury caused by intestinal ischemia on wound healing in the left colonic anastomoses:an experimental study in the murine model[J].Zafer Teke,Mustafa Sacar,Cigdem Yenisey,A.Ozgur Atalay,Tuncay Bicakci,Ergun Erdem.The American Journal of Surgery.2008(5)

[4]Microbubbles in ultrasound-triggered drug and gene delivery[J].Sophie Hernot,Alexander L.Klibanov.Advanced Drug Delivery Reviews.2008(10)

[5]高峰.超声分子影像显像胰岛移植IBMIR[D].中南大学,2010.