细菌基因组DNA快速提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

细菌基因组DNA快速提取试剂盒采用可以高效、专一结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，既适用于革兰氏阴性菌基因组DNA的提取，也可适用于革兰氏阳性菌基因组DNA的提取。本试剂盒也可用于食品致病菌(微生物)基因组提取，如：金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、出血性大肠杆菌O157：H7、单增李斯特、沙门氏菌、阪崎肠肝菌等。可从1-5 ml细菌培养液中，快速提取纯化10-40μg纯净的基因组DNA，所得基因组DNA可直接用作PCR模板、酶切、杂交等分子生物学实验。

细菌基因组DNA快速提取试剂盒

提取步骤:

1、取细菌培养物1-5ml(106-108个细胞,最多不超过2×109个细胞)置于离心管(自备)中,12000rpm(~~13400×g)离心1分钟,尽量吸净上清。

2、向沉淀中加入180μl Buffer GTL,振荡使菌体重悬。

3、加入20μl蛋白酶K,涡旋混匀,56℃孵育,直至溶液变清亮,孵育过程中每隔一段时间颠倒或震荡离心管使样本分散。

4、加入200μl Buffer GL,涡旋震荡充分混匀。加200μl无水乙醇,涡旋震荡充分混匀。短暂离心,使管壁上的溶液收集到管底。

5、将步骤4所得溶液(包括形成的沉淀)全部加入到已装入收集管的吸附柱中,若一次不能加完溶液,可分多次转入。12000rpm离心1分钟,弃废液,将吸附柱放回收集管中。

6、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇),12000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。

7、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇),12000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。

注意:如需进一步提高DNA纯度,可重复步骤7。

8、12000rpm离心2分钟,倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟,以彻底晾干。

9、将吸附柱置于一个新的离心管中,向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μl Buffer GE,室温放置2-5分钟,12000rpm离心1分钟,收集DNA溶液,-20℃保存DNA。

应用^[4][5]

用于水稻白叶枯病菌致病性功能基因组学分析研究

革兰氏阴性菌水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo）引起的白叶枯病是水稻（Oryza sativa L.）生产上最严重的细菌性病害,它也是研究植物——病原互作的重要模式菌。为研究Xoo致病分子机制,开展致病基因功能基因组学分析,我们用近年来广为使用的“鸟枪法”（shotgun）测序策略对PR6菌株基因组全序列进行测定。

构建三套高质量基因组文库,用小片段文库进行大规模序列测定。迄今己完成21211 reads测序工作,测序总长度达16459736 bp,约3.3倍基因组序列覆盖率。序列经初步组装获得529个Contigs,长度达4.94 Mb,得到了PR6菌株基因组全序列基本框架。组装序列分析发现,框架序列中能找到4555个（98.23%）编码蛋白基因序列与Xoo KACC 10331菌株序列高度同源。

这为进一步确定和分离Xoo致病基因及其功能基因组学分析奠定了基础。通过致病性分析,从17184个Tn5转座子插入突变体库中筛选到在水稻感病品种IR24上致病性明显下降或完全丧失的突变体332个。对其中的112个突变体Southern blot分析表明,有105个突变体（93.76%）的转座子在基因组上为单拷贝插入。在PSA培养基上,大多数致病性相关突变体的培养特征与野生型相同,能正常分泌胞外酶。通过TAIL-PCR分离的转座子侧翼片断属于46个基因,还有14个突变体的插入位点位于内源转座子或启动子上或基因间。

41个已经确定功能的基因中与分泌系统有关的超过三分之一（15个）,说明分泌系统对致病性有重要作用。其它主要是一些与胞外多糖、脂多糖合成有关及与细菌基础代谢和基因调节相关的基因。有15个突变体的转座子插入位点分别位于Ⅱ型分泌系统xps基因簇的6个基因上,PCR、Southern blot证实突变体确为转座子插入引起。突变体生长培养特征、胞外多糖分泌与野生型无明显差异,但胞外酶不能有效分泌。

通过测序和PCR方法得到11037 bp的xps基因簇全长序列,并克隆了其中的6个xps基因;序列同源性分析发现,PR6菌株的xps基因簇与其它病原黄单胞菌小种的序列同源性很高。初步的xps基因簇的SDS-PAGE、RT-PCR和Western blot分析发现,xps基因除共同启动子外,基因内可能还存在一些各自的启动子;突变体中至少有两种蛋白在胞间周质累积,其中有一种蛋白可能编码木聚糖酶。在112个致病性相关突变体中,发现有一转座子插入到编码芳香族氨基酸代谢途径DAHP合成酶基因（aroG基因）上的突变株。

参考文献

[1]Lipopolysaccharide biosynthesis in Xanthomonas campestris pv.campestris:a cluster of 15 genes is involved in the biosynthesis of the LPS O-antigen and the LPS core[J].F.-J.Vorh?lter,K.Niehaus,A.Pühler.Molecular Genetics and Genomics.2001(1)

[2]Xanthomonas campestris pv.campestris secretes the endoglucanases ENGXCA and ENGXCB:construction of an endoglucanase-deficient mutant for industrial xanthan production[J].K.Schr?ter,E.Flaschel,A.Pühler,A.Becker.Applied Microbiology and Biotechnology.2001(6)

[3]The lipopolysaccharides of the phytopathogen Xanthomonas campestris pv.campestris induce an oxidative burst reaction in cell cultures of Nicotiana tabacum[J].Andreas Meyer,Alfred Pühler,Karsten Niehaus.Planta.2001(2)

[4]Transposome Insertional Mutagenesis and Direct Sequencing of Microbial Genomes[J].Les M.Hoffman,Jerry J.Jendrisak,Ronald J.Meis,Igor Y.Goryshin,William S.Reznikoff.Genetica.2000(1)

[5]黄贵修.水稻白叶枯病菌致病性功能基因组学分析[D].华南热带农业大学,2005.