细胞表面蛋白分离试剂盒的应用

背景^[1-3]

细胞表面蛋白分离试剂盒可用于细胞膜表面蛋白分离，对哺乳动物细胞蛋白进行选择性生物素化，并随后进行纯化，以排除细胞内蛋白。

该试剂盒可高效标记具有可获取赖氨酸残基和充分细胞外暴露的蛋白。分离程序使用不可透过细胞的可裂解生物素化试剂（Sulfo-NHS-SS-生物素）来标记完整贴壁或悬浮细胞表面的蛋白上暴露的伯胺。之后收获并水解经处理的细胞，并使用Thermo Scientific NeutrAvidin琼脂糖树脂对标记的表面蛋白进行亲和纯化。分离出的细胞表面蛋白含一个原来标记伯胺、但不再生物素化（生物素保持连结至树脂）的小型、非反应标记。该试剂盒含足以进行八次实验的试剂，每次实验涉及装有融合细胞的四个T75瓶。

细胞表面蛋白分离试剂盒已成功用于标记和纯化细胞表面蛋白。在一次实验中，使用或不使用Sulfo-NHS-SS-生物素处理HeLa细胞，并根据试剂盒程序对细胞进行处理。通过Western印迹分析收集的组分，包括洗脱、流过物和洗脱后凝胶。在用生物素标记处理的细胞的洗脱组分中鉴定出四种细胞表面蛋白。这些蛋白包括表皮生长因子受体(EGFR)、胰岛素样生长因子-1受体βIGF(IGF-1β)、整合素1和整合素5。与之形成鲜明对比的是，在未标记细胞的洗脱组分中未鉴定出这些蛋白；未标记蛋白仅在流过物中发现。

细胞表面蛋白分离试剂盒

此外，还在来自标记细胞的流过物组分中鉴定出一些细胞表面蛋白。由于空间位阻，这些蛋白很可能未被标记。洗脱后凝胶组分中存在的已捕获蛋白量可忽略不计，表明已捕获蛋白回收率将近100%。在所有检测样品的洗脱组分中检测到了痕量热休克蛋白90(Hsp90)，表明细胞表面与细胞内蛋白标记具有特异性。

细胞表面蛋白分离试剂盒特点:

1.分离细胞表面蛋白,降低全细胞蛋白的复杂性。

2.高效回收标记的蛋白,使用可切除的生物素可得到接近100%的细胞表面蛋白的回收率。

3.方便,试剂盒提供实验所需的所有试剂,还提供标记、细胞裂解和纯化细胞表面膜蛋白的完整说明。

4.可用于蛋白免疫印迹,利用SDS-PAGE缓冲液回收的蛋白可直接进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

5.稳定可靠,实验方案适用于NIH 3T3、HeLa、C6及A431等多种细胞。

6.特异性,特异针对细胞表面蛋白的分离方法。

应用^[4][5]

用于细胞间粘附分子1Ⅰ～Ⅲ功能区蛋白的表达、分离与纯化研究

原核表达GST-ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能区融合蛋白,纯化后用凝血酶酶切融合蛋白去除GST标签,应用免疫亲和层析和高压液相方法探索蛋白分离纯化的条件,以获取ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能区蛋白。

构建重组质粒ZPET28aICAM-1,原核表达只带His标签的融合蛋白HisTag-ICAM-1,以获取ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能区蛋白。

方法:1.利用本室构建并保存的重组ZpET42aICAM质粒转化宿主菌E.ColiBL21（DE3）,IPTG诱导表达,表达产物用His.Tag融合蛋白纯化系统纯化,得到GST-ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能区融合蛋白。应用凝血酶对融合蛋白进行酶切,SDS-PAGE电泳鉴定酶切结果。用饱和硫酸铵法从本室制备的含兔抗人ICAM-1的兔血清中粗提IgG,再用Protein A Sepharose CL-4B凝胶进行IgG的进一步提纯,得到兔抗人ICAM-1的IgG纯品,经SDS-PAGE电泳鉴定后,用于CNBr-activited Sepharose CL-4B凝胶免疫亲和层析,得到ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能区蛋白;此外还探索应用高压液相方法对酶切后蛋白进行分离纯化。

2. 构建重组质粒ZPET28aICAM-1,质粒转化宿主菌E.Coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达,表达产物用His.Tag融合蛋白纯化系统纯化,得到His-ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能区蛋白。SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯化结果并计算分子量,Western Blot检测His-ICAM-1的免疫活性,考马斯亮蓝染色法定量,即可初步得到具有免疫学活性的ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能区蛋白。

结果:1.GST-ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能区融合蛋白的免疫亲和层析分离、纯化重组质粒ZpET42aICAM转化宿主菌后在条件下表达,表达产物用His.Tag融合蛋白纯化系统纯化。凝血酶在4℃酶切60小时,可以将GST-ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能区融合蛋白完全酶切开,SDS-PAGE电泳显示酶切后得到两条条带,即:ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能区蛋白,分子量为38.2kD和GST蛋白,分子量为28.0kD。开始免疫亲和层析后从3ml兔抗血清中用饱和硫酸铵法和Protein A凝胶亲和层析法提纯兔抗人ICAM-1IgG纯品,获得约6mg,再用于CNBr-activitedSepharose CL-4B凝胶进行的免疫亲和层析,初步得到具有免疫学活性的ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能区蛋白。

2.GST-ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能区融合蛋白的高压液相法分离、纯化凝血酶酶切后经SDS-PAGE电泳显示两条明显的条带,即GST和ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能区蛋白,经改变条件反复探索确定应用HPLC法流动相为3%乙腈,0.02%TFA,0.02M乙酸铵,PH值为6.0,在此条件下进样收集样品浓缩处理后,作SDS-PAGE和Western blot鉴定,发现虽有免疫学活性但是GST和ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能区蛋白未完全分开,依然显示两条条带。

3.His-ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能区融合蛋白的表达、纯化及鉴定构建重组质粒ZPET28aICAM-1,质粒转化宿主菌E.Coli BL21（DE3）,以IPTG为诱导剂,浓度1mM,20℃诱导6小时。表达产物用His.Tag融合蛋白纯化系统纯化。纯化后His-ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能区蛋白,产率为4.0 mg/L培养基。

参考文献

[1]Novel Association of ABO Histo-Blood Group Antigen with Soluble ICAM-1:Results of a Genome-Wide Association Study of 6,578 Women[J].Guillaume Paré,Daniel I.Chasman,Mark Kellogg,Robert Y.L.Zee,Nader Rifai,Sunita Badola,Joseph P.Miletich,Paul M.Ridker.PLOS Genetics.2008(7)

[2]Anti-angiogenesis:making the tumor vulnerable to the immune system[J].Arjan W.Griffioen.Cancer Immunology,Immunotherapy.2008(10)

[3]Intercellular Adhesion Molecule 1 Gene Polymorphisms in Graves’Disease[J].Adam Kretowski,Natalia Wawrusiewicz,Katarzyna Mironczuk,Janusz Mysliwiec,Malgorzata Kretowska,Ida Kinalska.The Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism.2003(10)

[4]Vascular Morphogenesis and Differentiation after Adoptive Transfer of Human Endothelial Cells to Immunodeficient Mice[J].Dag K.Skovseth,Takeshi Yamanaka,Per Brandtzaeg,Eugene C.Butcher,Guttorm Haraldsen.The American Journal of Pathology.2002(5)

[5]白庆双.细胞间粘附分子1Ⅰ～Ⅲ功能区蛋白的表达、分离与纯化[D].天津医科大学,2009.