全血总RNA试剂盒的应用

背景^[1-3]

全血总RNA试剂盒是在TRIzol LS的基础上改造而成，主要成分为TRIzol LS试剂。利用TRIzol LS中的高序盐成分，可使RNA结合于硅胶膜上，通过漂洗、洗脱即可获得高纯度RNA。该试剂盒专门用于血液、血浆/血清、病毒液等液体样品，可在最短的时间内获得高纯度的RNA。获得的总RNA纯度高，没有DNA和蛋白质污染，适用于RT-PCR、qRT-PCR、芯片分析、Northern Blot等实验。

全血总RNA试剂盒

产品特点：

1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。

2.不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

3.反复优化的红细胞裂解液配方，裂解效果快速完全。

4.快速，简捷，单个样品操作一般可在40分钟内完成。

5.多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.9～2.0，基本无DNA残留，可用于RT-PCR，Northern-blot和各种实验。

操作步骤：

1.在适合大小的RNase free离心管中加入1体积（<1.5mL）加入各种抗凝剂新鲜血液(颠倒混匀后)和3体积的红细胞裂解液RLB，颠倒混匀，可轻弹管壁，确保混匀。

2.室温放置10分钟（期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞）。如果RNA降解严重，可在冰上裂解，但是时间可长一些以充分裂解。

12000rpm离心20秒，倒弃红色上清，并小心的尽可能多的吸弃上清（注意不要吸到管底的细胞团），留下完整的管底白细胞团。

3.离心后在管底应该见到白色的白细胞团，也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起，但是如果看到的是大部分的红色细胞团，说明红细胞裂解很不充分，应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤2，3。上清尽可能的吸弃，残留过多会稀释裂解液，造成裂解结合异常，产量纯度降低。

4.涡旋或者轻弹管壁将白细胞沉淀完全松散重悬，加入350μL（<0.5mL全血）或者600μL（0.5～1.5mL全血）裂解液RLT，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。病人血样中白细胞数量可能大幅增加，应该适当减少处理量。或者按照350μL（＜2×106白细胞）或者600μL（2×106-1×107白细胞）比例加RTL。

5.用带钝针头的一次性1mL(配0.9mm针头)注射器抽打裂解物5～10次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。

6.较精确估计裂解物体积，加入等体积的70%乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!）此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

7.立刻将混合物(每次小于700μL，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13000rpm离心60秒，弃掉废液。

8.加700μL去蛋白液RW1，室温放置30秒，12，000rpm离心30秒，弃掉废液。

如果DNA残留明显，可在加入RW1后室温放置5分钟再离心。

9.加入500μL漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μL漂洗液RW，重复一遍。

10.将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

11.取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30～50μL RNase free water（事先在70～80℃水浴中加热效果更好），室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟。

应用^[4][5]

用于血液提取总RNA方法的优化及其在支气管肺发育不良患儿血液内TLK1表达的应用研究

采用实时定量荧光PCR（Real-Time PCR）技术定量检测支气管肺发育不良患儿血液标本内TLK1的含量，旨在初步探讨支气管肺发育不良患儿体内TLK1表达的情况。

研究方法1.以TRIZOL法为基本研究方法，通过分别提取等量全血、血浆及血清的总RNA，选择总RNA提取量最多的一种血液标本；随后，对不同血液量所提取的总RNA进行比较，得出的实验取血量。

2. 将上述抽取血液RNA的实验方法应用于临床标本检测，并对此方法进行验证：以来源于本院极早产新生儿重症监护病房（极早产NICU）内诊断为BPD的18名患儿抽取的静脉血为研究对象，根据病例组病例患儿的基本信息，以10名近胎龄、近似日龄的非BPD患儿抽取的静脉血为对照，分别采用TRIZOL法提取RNA，并采用反转录PCR（ReversedTranscript PCR）方法对所抽提的RNA反转录成cDNA。运用Real-Time PCR方法对BPD患儿血液TLK1产物做定量分析，采用△△Ct法，以GVPDH为内参，以非BPD患儿组为对照。

结果1.计算并通过比较TRIZOL法，在等量（0.1ml）全血、血浆及血清提取的总RNA的得率和质量分别为：全血提取RNA得率为（232.2904±58.42103）、纯度为（1.7421±0.6920），血浆提取RNA得率为（142.0728±45.24386）、纯度为（1.4765±0.5418），血清提取RNA的率为（198.7496±51.47629）、纯度为（1.5833±0.6257），因此，全血提取的总RNA的得率明显优于血清及血浆，总RNA的纯度也最高；

2.以不同的全血量通过不同剂量的TRIZOL提取总RNA比较，在0.1-1ml的全血量的范围内，以适量的TRIZOL提取的总RNA的量，全血量越多，提取的RNA的得率及纯度越高，但是，全血量越多，提取完整总RNA所需TRIZOL量越多，将不利于后期实验操作，因此选取的全血量进行提取血液RNA的实验对患者及后期实验研究非常重要。实验结果表明以0.3ml的全血量及1mlTRIZOL即可得到完整的总RNA量，且纯度也能达到1.8-2.0这一标准值，临床取血量相对较少，是的实验取血量；

3.以上述实验全血量（0.3ml）及实验方法对支气管肺发育不良组及对照组共28个样本提取RNA，除1个样本外，其余27个样本提取的总RNA的得率及纯度均在标准范围内，证明此提取血液RNA的实验方法有效。

参考文献

[1]TAT-Mediated Delivery of Tousled Protein to Salivary Glands Protects Against Radiation-Induced Hypofunction[J].Gulshan Sunavala-Dossabhoy,Senthilnathan Palaniyandi,Charles Richardson,Arrigo De Benedetti,Lisa Schrott,Gloria Caldito.International Journal of Radiation Oncology,Biology,Physics.2012(1)

[2]VEGF levels in humans and animal models with RDS and BPD:Temporal relationships[J].Stephanie Meller,Vineet Bhandari.Experimental Lung Research.2012(4)

[3]The Tousled-Like Kinases as Guardians of Genome Integrity[J].Arrigo De Benedetti,Y.-K.Jang,Y.B.Lebedev,A.J.Molenaar.ISRN Molecular Biology.2012

[4]Silencing of Tousled-like kinase 1 sensitizes cholangiocarcinoma cells to cisplatin-induced apoptosis[J].Yuichi Takayama,Toshio Kokuryo,Yukihiro Yokoyama,Satoko Ito,Masato Nagino,Michinari Hamaguchi,Takeshi Senga.Cancer Letters.2010(1)

[5]张珊.血液提取总RNA方法的优化及其在支气管肺发育不良患儿血液内TLK1表达的应用[D].山西医科大学,2014.