植酸酶(PHYTASE)试剂盒的应用

背景^[1-3]

植酸酶(PHYTASE)试剂盒可以通过植酸酶(PHYTASE)的紫外吸收强弱来测定样本中植酸酶(PHYTASE)的含量。

测定原理：

植酸酶在一定温度和pH值条件下，水解底物植酸钠生成无机磷与肌醇衍生物，无机磷在酸性环境中与钼酸铵显色剂反应生成蓝色复合物，在700nm处有特征吸收峰，根据700nm处吸光值变化可计算得植酸酶活性。

植酸酶是一种胞外酶,广泛存在于自然界中,在动物、植物、微生物中均有发现。在植物组织如谷物、豆类、蔬菜,特别是萌发的种子和花粉中都发现了植酸酶。此外，自然界中产植酸酶的微生物种类繁多,如细菌、霉菌、真菌等

植酸酶从广义上讲,是指与植酸分解有关的酶类,它实际上包括植酸酶和磷酸酶,植酸酶只能将植酸分解为肌醇磷酸酷系列,不能彻底地将肌醇磷酸酩分解为肌醇和磷酸。

植酸酶(EC.3.1.3.8,肌醇六磷酸盐磷酸水解酶)可催化肌醇六磷酸(盐或醋)脱掉磷酸基团,植酸酶现知有3种类型,即肌醇六磷酸3一磷酸水解酶、肌醇六磷酸6一磷酸水解酶和非特异性的正磷酸单酷水解酶,它们分别在肌醇六磷酸的3位、6位和2位碳上水解掉1个磷酸基因。这是广义的植酸酶,狡义的植酸酶不包括磷酸酶。

植酸酶(PHYTASE)试剂盒

植酸酶（phytase）是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸（盐）的一类酶的总称，属磷酸单酯水解酶,它能将食品和饲料中植酸及其盐转化为可供有机体利用的有效磷，降低粪便中的磷含量，减轻对环境的污染，改善营养成分的吸收和利用，因此具有极其广泛的研究和应用价值。

应用^[4][5]

用于植酸酶耐热突变体的筛选及其异源高效表达研究

利用易错PCR技术构建E.coli植酸酶突变体文库,通过高通量筛选得到三株热稳定性显著提高的E.coli植酸酶APPA突变体,根据其氨基酸序列使用SWISS-MODEL和Swiss-Pdb Viewer进行三维建模和突变位点结构分析,并且通过基因工程技术构建出多基因剂量耐高温植酸酶毕赤酵母（Pichia pastoris）工程菌,将其接种于3.6 L发酵罐进行放大发酵。

主要结果如下:（1）应用基于易错PCR随机突变的分子进化技术对E.coli来源的植酸酶APPA进行突变,连接在p ET22b（+）载体上,转化于E.coli BL21（DE3）构建植酸酶突变体文库,并用钼蓝法高通量筛选热稳定性较野生型显著提高的突变体,结果显示,三株突变体经90°C高温处理5 min后酶活分别为:APPA1为1.923 U·m L-1、APPA2为3.354 U·m L-1、APPA3为3.746 U·m L-1,野生型菌株高温处理后未检测出酶活,表明三株突变体的热稳定性较野生型有很大提高。

（2）通过测序获得突变体的核酸序列,经过密码子优化后连接在op SP2信号肽和p PIC9K载体上,使用P.pastoris X33作为宿主进行分泌表达。使用阴离子交换层析纯化后,分别从最适p H、p H稳定性、最适温度、热稳定性和动力学参数对耐热植酸酶突变体进行酶学性质研究,并分别利用SWISS-MODEL和Swiss-Pdb Viewer进行三维建模和突变位点结构分析,根据分析结果推测突变体二级结构上引进新氢键可能是热稳定性提高的主要因素。

（3）以P.pastoris表达质粒p PIC9K-op SP2-op APPA3和改造质粒p PIC9K-（Amp-3’AOX-Xba I-del）为模板进行PCR扩增,得到单基因剂量表达盒片段和载体片段,使用一步克隆技术构建单基因剂量表达载体,再通过基因剂量反复整合表达质粒构建多基因剂量菌株,通过G418抗性平板和摇瓶筛选获得植酸酶高产菌株。摇瓶结果显示随着植酸酶突变体基因剂量的增加,重组菌株发酵液中的酶活和蛋白含量均有所提高,单基因剂量菌株N1、双基因剂量菌株N2、三基因剂量菌株N3、四基因剂量菌株N4、五基因剂量菌株N5的酶活分别为24.996 U·m L-1、45.374 U·m L-1、74.921 U·m L-1、106.845 U·m L-1、117.829 U·m L-1,多基因剂量菌株N2、N3、N4、N5的酶活比单基因剂量菌株N1分别提高81.5%、199.7%、327.4%、371.4%。其中四基因剂量菌株N4比酶活达到116.010 U·mg-1,是单基因剂量菌株的2.75倍。

（4）将能够高产植酸酶的五基因剂量菌株接种于3.6 L发酵罐进行放大发酵,发酵工艺为:接种时间24 h,接种量10%,诱导菌体浓度OD600为100,诱导温度28°C,甲醇浓度0.5%（v/v）,诱导表达时间96 h。最终发酵液的酶活和蛋白含量分别达到1095.051U·m L-1和1.232 mg·m L-1,在诱导72 h时比酶活最高,达到1037.974 U·mg-1。

参考文献

[1]A multistrategy approach for improving the expression of E.coli phytase in Pichia pastoris.[J].Helian Yuankun,Gai Yuanming,Fang Huan,Sun Yumei,Zhang Dawei.Journal of industrial microbiology&biotechnology.2020(prep)

[2]Efficient Phytase Secretion and Phytate Degradation by Recombinant Bifidobacterium longum JCM 1217.[J].Sun Zhongke,Yue Zonghao,Yang Xingdong,Hao Xinqi,Song Maoping,Li Lili,Chen Can,Chu Cuiwei,Li Chengwei.Frontiers in microbiology.2019

[3]A rational design to enhance the resistance of Escherichia coli phytase appA to trypsin.[J].Wang Xi,Du Jun,Zhang Zhi-Yun,Fu Yue-Jun,Wang Wen-Ming,Liang Ai-Hua.Applied microbiology and biotechnology.2018(22)

[4]Microbial phytase:Impact of advances in genetic engineering in revolutionizing its properties and applications[J].Mrudula Vasudevan Ushasree,Krishna Shyam,Jalaja Vidya,Ashok Pandey.Bioresource Technology.2017

[5]陈中伟.植酸酶耐热突变体的筛选及其异源高效表达[D].江南大学,2021.