大鼠心肌细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠心肌细胞胞分离自心脏组织；心脏是脊椎动物身体中最重要的一个器官，主要功能是为血液流动提供压力，把血液运行至身体各个部分。心脏由心肌构成，左心房、左心室、右心房、右心室四个腔组成。左右心房之间和左右心室之间均由间隔隔开，故互不相通，心房与心室之间有瓣膜（房室瓣），这些瓣膜使血液只能由心房流入心室，而不能倒流。心脏的作用是推动血液流动，向器官、组织提供充足的血流量，以供应氧和各种营养物质，并带走代谢的终产物（如二氧化碳、无机盐、尿素和尿酸等），使细胞维持正常的代谢和功能。心肌细胞呈菱形、多边形等不规则形状；细胞培养2h后开始贴壁，呈梭形；到12h左右，细胞开始伸出伪足，呈菱形、多角形；细胞分离培养48h以后，大部分伸出伪足、呈巴掌状，部分心肌细胞会出现搏动；心肌细胞为终末分化细胞，在体外不增殖。

大鼠心肌细胞

体外培养的心肌细胞可保持结构及功能上的某些特点，并具有自发性节律搏动，且心肌细胞的培养具有简便、定量、重复性好以及不受神经体液因素的影响等特点。利用培养的心肌细胞在探索非血液动力学因素所致的心肌肥厚的调节，研究心肌细胞的生物力学、凋亡、受体下调、缺血预处理、信号通路、对作用于心脏的新药进行筛选并对其安全性进行评价以及从培养的心肌细胞中提取有价值的生物因子等方面具有广阔的应用前景，对于研究其生理功能、药物作用以及各种致病因素作用下的病理生理改变具重要意义。

使用方法

大鼠心肌细胞是一种贴壁细胞，细胞形态程梭形、多角形，在Procell技术部标准操作流程下，细胞属于终末分化细胞；属于不增殖细胞群；建议您收到细胞后尽快进行相关实验。

操作步骤：

1.取出T25细胞培养瓶，用75%酒精消毒瓶身，拆下封口膜，放入37℃、5%CO2、饱和湿度

的细胞培养箱中静置3-4h，以稳定细胞状态。

2.贴壁细胞消化

1）吸出T25细胞培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液1mL至T25培养瓶中，轻微转动培养瓶至消化液覆盖整个培养瓶底后，吸出多余胰蛋白酶消化液，37℃温浴1-3min；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后，再加入3-5ml完全培养基终止消化；

3）用吸管轻轻吹打混匀，调整合适密度按实验需求接种对应实验器皿，然后按器皿大小补充适当新鲜的完全培养基，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养；

4）待细胞完全贴壁后，培养观察，用于实验；之后按照换液频率更换新鲜的完全培养基。

3.细胞实验

因原代细胞贴壁特殊性，贴壁的原代细胞在消化后转移至其他实验器皿（如玻璃爬片、培养板、共聚焦培养皿等）时，需要对实验器皿进行包被，以增强细胞贴壁性，避免细胞因没贴好影响实验；包被条件常选用鼠尾胶原Ⅰ（2-5μg/cm2），多聚赖氨酸PLL（0.1mg/ml），明胶（0.1%），依据细胞种类而定。悬浮/半悬浮细胞无需包被。

应用^[4][5]

用于生理和心肌肥厚状态下小檗碱对成年大鼠心肌细胞钙调控的机制研究

小檗碱不仅对健康大鼠离体心脏和左心室组织具有正性肌力作用,而且能够抑制高血压诱导的大鼠心肌肥厚。

探究生理状态下小檗碱对成年大鼠心肌细胞的钙调控机制和在病理状态下从钙调控角度阐明小檗碱抗心肌肥厚的作用机制。这将为临床上应用小檗碱预防和治疗心衰提供有力的理论依据,对心血管疾病的治疗具有深远的意义。

研究目标:1.研究生理状态下小檗碱对大鼠左心室心肌细胞的钙调控机制;2.基于钙调控阐明小檗碱抗大鼠心肌肥厚的作用机制。

研究方法和结果:1.生理状态下小檗碱对大鼠左心室心肌细胞中Ca2+浓度的影响方法:利用激光共聚焦显微镜和钙离子探针Fluo4-AM,检测小檗碱对成年大鼠左心室心肌细胞（adult rat left ventricular cardiomyocytes,ARCs）中Ca2+浓度的的影响。

结果:（1）在静息状态下,30-300μM小檗碱显著增大ARCs中的荧光强度。

（2）在电刺激条件（15 V,4 ms,1 Hz）下,100-300μM小檗碱显著增大ARCs钙瞬变最高点（peak）和基线（baseline）处的荧光强度。以上结果表明,小檗碱能够升高ARCs中Ca2+浓度。

2. 生理状态下小檗碱对大鼠左心室心肌细胞Ca2+内流的影响方法:（1）利用激光共聚焦显微镜和钙离子探针Fluo4-AM,结合无钙KH溶液探究Ca2+内流与小檗碱升高ARCs中Ca2+浓度的关系。

（3）利用LTCCs抑制剂硝苯地平和激动剂FPL-64176,探究LTCCs介导的Ca2+内流与小檗碱升高ARCs中Ca2+浓度的关系。

（4）利用低钠溶液或反向钠钙交换泵(Na+-Ca2+exchanger,NCX)抑制剂,探究反向NCX介导的Ca2+内流与小檗碱升高ARCs中Ca2+浓度的关系。

（5）利用反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）技术和Western-blot技术,分别在m RNA和蛋白水平上检测小檗碱对相关离子通道基因表达水平的影响。

结果:（1）在无钙KH溶液中,300μΜ小檗碱增大ARCs中荧光强度的作用被显著抑制（p<0.001）。

（2）10μM硝苯地平对300μΜ小檗碱增大ARCs中荧光强度的作用无显著影响。先给予10μM FPL-64176后,ARCs中的荧光强度增大;随后,300μΜ小檗碱能够进一步增大ARCs中的荧光强度（p<0.001）。

（3）低钠溶液、1 m M Ni Cl2和5μM KB-R7943均显著抑制300μM小檗碱升高ARCs中荧光强度的作用（p<0.001）。

（4）30-300μM小檗碱对NCX1 m RNA和蛋白的表达水平无显著影响。以上结果表明,小檗碱可通过激活反向NCX促进Ca2+内流而升高ARCs中Ca2+浓度。

参考文献

[1]Cardiac Alternans Occurs through the Synergy of Voltage-and Calcium-Dependent Mechanisms[J].HoangTrong Minh Tuan,Ullah Aman,Lederer William Jonathan,Jafri Mohsin Saleet.Membranes.2021(10)

[2]Physiological Functions of CRAC Channels.[J].Emrich Scott M,Yoast Ryan E,Trebak Mohamed.Annual review of physiology.2021

[3]The Physiology and Pathophysiology of T-Tubules in the Heart[J].Setterberg Ingunn E.,Le Christopher,Frisk Michael,Li Jia,Louch William E..Frontiers in Physiology.2021

[4]Phosphorylation of RyR2 Ser-2814 by CaMKII causesβ1-adrenergic stress and subsequent Ca2+-leak from the sarcoplasmic reticulum.[J].Baier Maria J,Noack Jannis,Seitz Mark Tilmann,Maier Lars S,Neef Stefan.FEBS open bio.2021(10)

[5]赵军利.生理和心肌肥厚状态下小檗碱对成年大鼠心肌细胞钙调控的机制研究[D].西南大学,2021.