小鼠白介素2 ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

小鼠白介素2 ELISA试剂盒用于测定人血清、血浆、组织及相关液体样本中白介素2的含量或活性。

实验原理：

小鼠白介素2 ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（elisa）。往预先包被小鼠白介素2(IL-2)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的小鼠白介素2(IL-2)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

小鼠白介素2 ELISA试剂盒

标本要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

操作步骤:

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于雷帕霉素联合调节性T细胞对受体小鼠移植心脏及抗肿瘤免疫的影响研究

研究短期使用雷帕霉素联合调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）在诱导同种异体小鼠心脏移植物长期存活,同时探讨此方案对移植受体肿瘤免疫的影响。

方法：免疫磁珠法分离得到受体小鼠脾脏Treg,经CD3/CD28单克隆抗体磁珠及2000 U/mL重组小鼠白介素2（recombinant murine IL-2,rmIL-2）体外扩增后,流式细胞术检测纯度;建立小鼠腹腔同种异体心脏移植模型（H-2b到H-2d）,分为对照组（单纯移植）、雷帕霉素组、雷帕霉素联合Treg组。雷帕霉素组连续14 d经腹腔注射雷帕霉素1mg/（kg·d）,雷帕霉素联合Treg组注射相同剂量的雷帕霉素,并于移植当天经尾静脉过继输注扩增后的Treg（1×107/只）,同时设同基因移植组（H-2d到H-2d）,每日观察移植心脏搏动并在相应时点进行组织学评价。

在受体肿瘤免疫实验中设三组同种异体心脏移植（H-2b到H-2d）,同时经尾静脉过继输注B16-F10细胞（H-2b）（供体来源）,另三组同种异体心脏移植（H-2d到H-2b）小鼠经尾静脉过继输注B16-F10细胞（H-2b）（受体来源）,两周后比较肺部肿瘤结节数量。结果CD4+CD25+Foxp3+Treg扩增前纯度为86.68%±0.02%（n=5）,体外加入扩增2周后Treg数量达到了初始数量的3040倍,流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+Treg纯度为84.58%±0.03%,与扩增前相比差异无统计学意义（P>0.05）。

对照组移植心脏中位生存时间（MST）为7 d,雷帕霉素组为15 d,雷帕霉素联合Treg过继输注能够显著延长移植心脏MST至93 d,组织学显示长期存活心脏淋巴细胞浸润及慢性血管病变;对于供体来源肿瘤,对照组未见肿瘤结节,雷帕霉素组为（15±8）个,雷帕霉素联合Treg组小鼠肺部肿瘤结节为（14±7）个,后2组类似无显著性差异;对于受体来源肿瘤,对照组肿瘤结节为（70±12）个、雷帕霉素组为（28±9）个、雷帕霉素联合Treg组小鼠肺部肿瘤结节为（146±12）个,与对照组、雷帕霉素组相比均显著增加。结论短期使用低剂量雷帕霉素联合Treg能够显著延长小鼠移植心脏的存活时间,但仍不能抑制受体肿瘤的发生。

参考文献

[1]Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells[J].Bluestone Jeffrey A.,Buckner Jane H.,Fitch Mark,Gitelman Stephen E.,Gupta Shipra,Hellerstein Marc K.,Herold Kevan C.,Lares Angela,Lee Michael R.,Li Kelvin,Liu Weihong,Long S.Alice,Masiello Lisa M.,Nguyen Vinh,Putnam Amy L.,Rieck Mary,Sayre Peter H.,Tang Qizhi.Science Translational Medicine.2015(315)

[2]Therapy of type 1 diabetes with CD4+CD25 high CD127-regulatory T cells prolongs survival of pancreatic islets—Results of one year follow-up[J].Natalia Marek-Trzonkowska,Ma?gorzata My?liwiec,Anita Dobyszuk,Marcelina Grabowska,Ilona Derkowska,Jolanta Ju?cińska,Rados?aw Owczuk,Agnieszka Szadkowska,Piotr Witkowski,Wojciech M?ynarski,Przemys?awa Jarosz-Chobot,Artur Bossowski,Janusz Siebert,Piotr Trzonkowski.Clinical Immunology.2014(1)

[3]Attenuation of Donor‐Reactive T Cells Allows Effective Control of Allograft Rejection Using Regulatory T Cell Therapy[J].K.Lee,V.Nguyen,K.‐M.Lee,S.‐M.Kang,Q.Tang.American Journal of Transplantation.2014(1)

[4]Clinical application of regulatory T cells in type 1 diabetes[J].Natalia Marek‐Trzonkowska,Ma?gorzata My?liwec,Janusz Siebert,Piotr Trzonkowski.Pediatr Diabetes.2013(5)

[5]闫挺.雷帕霉素联合调节性T细胞对受体小鼠移植心脏及抗肿瘤免疫的影响[D].重庆医科大学,2017.