小鼠Β-伴大豆球蛋白(Β-CY)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

小鼠Β-伴大豆球蛋白(Β-CY)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中小鼠β-伴大豆球蛋白（β-CY）的含量。

实验原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被小鼠β-伴大豆球蛋白（β-CY）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的小鼠β-伴大豆球蛋白（β-CY）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

小鼠Β-伴大豆球蛋白(Β-CY)ELISA试剂盒

操作步骤：

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

试剂盒性能

1.检测范围：0.25 mg/ml–8 mg/ml。

2.灵敏度：最低检测浓度小于0.1 mg/ml。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重复性：板内变异系数小于10%，板间变异系数小于15%。

应用^[4][5]

用于大豆β-伴大豆球蛋白α’-亚基基因RNAi表达载体的构建及表达调控的研究

研究根据RNA干扰技术原理,克隆了β-伴大豆球蛋白α’-亚基基因的核心保守序列中一段400bp大小的片段,采用基因工程手段,分别构建了以抗除草剂Bar基因和耐盐碱BADH基因为筛选标记的a’-亚基基因ihp-RNAi高效表达载体p3301-PFNZ和p3301-PFNZ-BADH两个单价表达载体及以Bar基因为筛选标记的双价表达载体p3301-α’+β。通过农杆菌介导法和花粉管通道法将两个单价表达载体导入大豆,经过抗性筛选,并对转基因植株进行PCR检测,Southern blot杂交,]RT-PCR和ELISA检测,以期应用RNA干扰技术对β-伴大豆球蛋白α’-亚基基因的表达调控加以研究,为应用基因工程技术进行大豆品质改良奠定了基础。

主要实验结果如下：分别克隆了构成ihp-RNAi表达载体结构的4个片段：种子特异性启动子7ap,α’-亚基基因正义和反义片段及功能性间隔序列intron-s。以植物表达载体pCAMBIA3301为基础,经双酶切连接的方法依次连入种子特异性启动子7αp、α’-亚基基因反义片段,功能性间隔序列intron-s和α’-亚基基因正义片段,构成以植物表达载体pCAMBIA3301本身带有的抗除草剂Bar基因为筛选标记的ihp-RNAi表达载体p3301-PFNZ。克隆耐盐碱基因BADH,利用XholⅠ单酶切替换了表达载体p3301-PFNZ中的抗除草剂基因Bar,并通过EcoRⅠ单酶切鉴定方向后,构建了以BADH基因为筛选标记的安全型植物表达载体p3301-PFNZ-BADH。

将已克隆好的p-伴大豆球蛋白β-亚基基因的正义片段和反义片段分别插入到启动子7αp下游和终止子nos上游,并通过酶切鉴定其插入方向,构建成β-伴大豆球蛋白a’-亚基和β-亚基的双价ihp-RNAi表达载体p3301-α’+β。采用农杆菌介导法将两个单价表达载体导入受体大豆,经抗性筛选和PCR初步检测得到耐盐碱的T0代“吉农27”转基因大豆15株,抗草铵膦T0代“吉农28”转基因大豆10株,转化率为2.1%。

采用花粉管通道法将两个单价表达载体导入受体大豆,共获得780粒转化籽粒,其中转p3301-PFNZ-BADH籽粒：“吉农27"125粒,“吉新豆1号”112粒,“通农13"143粒；转p3301-PFNZ籽粒：“吉农27"123粒,“吉新豆1号”131粒,“通农13"146粒。经抗性筛选并PCR检测,从获得的幼苗中初步筛选出耐盐碱阳性植株“吉农27"10株,“吉新豆1号”7株,“通农13"5株；抗草铵膦阳性植株：“吉农27"8株,“吉新豆1号”6株,“通农13"5株；平均转化率为3.2%。对转基因后代进行PCR检测,获得农杆菌介导法转化的T1代阳性植株45株,其中耐盐碱“吉农27”T1代阳性植株25株,抗草铵膦“吉农28”T1代阳性植株20株。

为了进一步鉴定表达载体的T-DNA区是否整合到大豆基因组中,随机分别抽取吉农27和吉农28的T1代阳性植株提取基因组,以BADH/Bar为探针进行Southern杂交检测,结果阳性植株均出现杂交信号,非转基因植株没有出现杂交信号,由此证明两个单价表达载体的T-DNA区已整合到大豆基因组中。

参考文献

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[3]Assessment of the food safety issues related to genetically modified foods[J].Gijs A.Kleter,Hub P.J.M.Noteborn,Esther J.Kok.The Plant Journal.2001(6)

[4]Construct design for efficient,effective and high‐throughput gene silencing in plants[J].S.VarshaWesley,Christopher A.Helliwell,Neil A.Smith,MingBoWang,Dean T.Rouse,QingLiu,Paul S.Gooding,Surinder P.Singh,DavidAbbott,Peter A.Stoutjesdijk,Simon P.Robinson,Andrew P.Gleave,Allan G.Green,Peter M.Waterhouse.The Plant Journal.2001(6)

[5]李夏.大豆β-伴大豆球蛋白α'-亚基基因RNAi表达载体的构建及表达调控的研究[D].吉林农业大学,2012.