人谷氨酸脱氢酶(GDH)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人谷氨酸脱氢酶(GDH)ELISA试剂盒特异性检测血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清、组织匀浆等样本中谷氨酸脱氢酶(GDH)的含量。

实验原理：人谷氨酸脱氢酶（GDH/GLDH）酶联免疫吸附测定试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗人GDH/GLDH抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的GDH/GLDH与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗人GDH/GLDH抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗人GDH/GLDH抗体与结合在包被抗体上的人GDH/GLDH结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物（TMB），TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，GDH/GLDH浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中GDH/GLDH的浓度。

人谷氨酸脱氢酶(GDH)ELISA试剂盒

操作步骤：

1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。

4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5．每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。

8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9．在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断与分析：

1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值

2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的指标标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度,再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

应用^[4][5]

用于植物乳杆菌ZDY 2013的耐酸机制研究及其谷氨酸脱氢酶基因的克隆表达研究

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）广泛存在于发酵的蔬菜和果汁中,在食品、饲料及医疗保健等领域受到高度关注。植物乳杆菌作为人体胃肠道中重要的益生菌群,为了有效发挥益生功能,必须耐受胃液中的极端酸性环境,以较高的存活率抵达人体肠道中。因此,乳酸菌的耐酸性成为选择益生菌的标准之一。

研究以植物乳杆菌ZDY 2013为实验菌株,植物乳杆菌ATCC 8014为对照菌株,利用生理生化测定的研究方法,分析比较两株植物乳杆菌在酸性环境中的生理耐受现象,探讨其机制。此外,借助基因工程的方法,构建谷氨酸脱氢酶原核表达载体,阐释谷氨酸脱氢酶对提高工程菌耐酸性能的作用,从而为提升植物乳杆菌抵御酸胁迫的能力提供有效策略。

主要研究结果如下:1、从细胞生理学水平比较植物乳杆菌ZDY 2013和ATCC 8014在酸应激中的生理变化。扫描电镜观察发现,两株植物乳杆菌酸处理后均出现形态结构的变化,其中植物乳杆菌ZDY 2013在酸性环境中可以更好地维持细胞形态和细胞膜完整性,缓解酸应激对细胞产生的损伤。对植物乳杆菌胞内pH值测定结果表明,植物乳杆菌ZDY 2013在酸性环境中较ATCC 8014保持更高的胞内pH值。此外,植物乳杆菌ZDY 2013的Na+,K+-ATPase活性和胞内ATP含量在酸性环境中分别比ATCC 8014高出35%和41%。植物乳杆菌胞内氨基酸含量测定结果表明,植物乳杆菌ZDY 2013在酸环境中具有更高的胞内精氨酸、谷氨酸、丙氨酸和组氨酸含量。精氨酸脱亚胺酶和谷氨酸脱羧酶酶活测定结果表明,植物乳杆菌ZDY 2013在酸性环境中的精氨酸脱亚胺酶和谷氨酸脱羧酶活力分别是ATCC 8014的1.2和1.3倍。

2、以植物乳杆菌ZDY 2013基因组DNA为模板,PCR扩增谷氨酸脱氢酶基因,连接到表达载体pET-32a（+）上,重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达和镍柱亲和层析后获得目的蛋白,活性测定显示该蛋白具有谷氨酸脱氢酶的活性。同时,对表达菌株的酸耐受性测定结果表明,工程菌株在pH 4.5的存活率提高1.4倍。

参考文献

[1]Transcriptomic and proteomic analysis of Oenococcus oeni PSU-1 response to ethanol shock[J].Nair Olguín,Marie Champomier-Vergès,Patricia Anglade,Fabienne Baraige,Ricardo Cordero-Otero,Albert Bordons,Monique Zagorec,Cristina Reguant.Food Microbiology.2015

[2]Physiological and transcriptional responses and cross protection of Lactobacillus plantarum ZDY2013 under acid stress[J].Renhui Huang,Mingfang Pan,Cuixiang Wan,Nagendra P.Shah,Xueying Tao,Hua Wei.Journal of Dairy Science.2015

[3]Cellular fatty acid profile and H+-ATPase activity to assess acid tolerance of Bacillus sp.for potential probiotic functional attributes[J].P.Shobharani,Prakash M.Halami.Applied Microbiology and Biotechnology.2014(21)

[4]Glutamine,glutamate,and arginine-based acid resistance in Lactobacillus reuteri[J].Januana S.Teixeira,Arisha Seeras,Alma Fernanda Sanchez-Maldonado,Chonggang Zhang,Marcia Shu-Wei Su,Michael G.G?nzle.Food Microbiology.2014

[5]田喜梅.植物乳杆菌ZDY 2013的耐酸机制研究及其谷氨酸脱氢酶基因的克隆表达[D].南昌大学,2016.