Recombinant Protein A, His-tag

背景^[1][2][3]

最早获得Recombinant Protein A的方法是从金黄色葡萄球菌中直接纯化获得,然而这种方法存在一些问题,例如Recombinant Protein A只占菌体总蛋白的,难以满足大规模生产的需要,且金黄色葡萄球菌为致病菌,大规模生产危险性较大。为避免这些问题,人们开始转向采用基因工程技术来生产Recombinant Protein A,寻求大规模生产蛋白安全可行的途径。

Recombinant Protein A的研发起源于年代初期的欧美,美国的公司最早申请了关于的专利,首次成功将Recombinant Protein A的基因在大肠杆菌中克隆和表达,次年,英国人和紧随其后,也发表了相似的工作。目前的研发已经有几十年的历史,产业化格局业已形成。美国公司是全球的从事研发和生产的专业公司,该公司有近年的生产历史,在大肠杆菌表达系统的构建、基因表达调控、高密度培养、分离纯化口等方面均作了系统的研究,开发了相应的技术,并分别获得了表达和纯化的相关专利。

该公司现在有多种形式的产品出售,其中具有与天然蛋白完全相同的基因序列和相对分子量,纯度大于。目前,全球已上市的单克隆抗体药物中,有超过一半的纯化都用到了公司生产的,其中公司生产的蛋白亲和层析介质就是采用了该公司的。我国临床蛋白免疫吸附材料所用的也均为该公司产品,在临床治疗中表现出了很好的疗效,而且副作用小。

同时,利用基因工程技术生产,还可以通过基因水平上的改造制备能够耐受恶劣环境稳定性高的衍生物。构建并表达了多种含蛋白的融合蛋白,发现在端融合蛋白或一葡萄糖醛酸酶后,能够提高其端对蛋白酶降解的耐受性,且这种融合并不影响蛋白的结合活性。等以蛋白的结构域为底物。

国内生产Recombinant Protein A上存在的主要问题是产品纯度低,非特异性吸附大,对抗体的亲和力不高,但生产的成本却很高,导致售价比进口同类产品还略高。产生这些问题的主要原因是国内在Recombinant Protein A的基因构建、表达以及生产工艺等环节缺乏系统深入的研究,其中最关键的问题之一就是纯化工艺还有待提高。

His-Tag络合作用

固定化金属离子亲合层析Immobilizedmetalionaffinitychromatography,IMAC)，简称金属螯合亲合层析，是一种新型的应用于原核蛋白纯化的技术。该方法通过蛋白质表面的一些特殊的氨基酸，使之与金属离子发生相互作用，从而对蛋白质进行亲和纯化。这些作用包括配价键结合、静电吸附、共价键结合等，其中以6个组氨酸残基组合的融合标签（His-Tag）在原核蛋白表达中的应用最为显著。

Recombinant Protein A，His-tag定义及意义^[1][2][3]

重组蛋白A基因的核苷酸序列如下：

GAATTCATAT  GGTGGTAGAC  AACAAATTCA  ACAAAGAACA  ACAAAACGCG  TTCTATGAGA TCTTACATTT  ACCTAACTTA  AACGAAGAAC  AACGAAACGC  CTTCATCCAA  AGTTTAAAAG ATGACCCAAG  CCAAAGCGCT  AACCTTTTAG  CAGAAGCTAA  AAAGCTAAAT  GATGCTCAGG CGCCGAAAGT  AGACAACAAA  TTCAACAAAG  AACAACAAAA  CGCGTTCTAT  GAGATCTTAC ATTTACCTAA  CTTAAACGAA  GAACAACGAA  ACGCCTTCAT  CCAAAGTTTA  AAAGATGACC CAAGCCAAAG  CGCTAACCTT  TTAGCAGAAG  CTAAAAAGCT  AAATGATGCT  CAGGCGCCGA AAGTAGACAA  CAAATTCAAC  AAAGAACAAC  AAAACGCGTT  CTATGAGAC  TTACATTTAC CTAACTTAAA  CGAAGAACAA  CGAAACGCCT  TCATCCAAAG  TTTAAAAGAT  GACCCAAGCC AAAGCGCTAA  CCTTTTAGCA  GAAGCTAAAA  AGCTAAATGA  TGCTCAGGCG  CCGAAAGTAG ACTAAGGATC  C

His-tag 是重组蛋白表达最常用的标签，无论表达的蛋白是可溶的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和层析（IMAC）纯化。 金属螯合亲合层析，又称固定化金属离子亲合层析（Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC），是近30年发展起来的一种新型分离技术。最早由Paroth等人提出。该方法利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等能和金属离子发生特殊的相互作用的原理，从而对蛋白质加以分离。这些作用包括配价键结合、静电吸附、共价键结合，其中以配价键结合为主，而且这其中又以6组氨酸标签（His-Tag）应用最为广泛。

以His-Tag纯化标签结合金属螯合亲合层析，为重组蛋白质的分离纯化提供了一个有力的工具。由于金属螯合亲合层析具有配体简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，上样条件可选择范围广，在高盐、一定浓度的变性剂以及去垢剂的条件下，带6His纯化标签的蛋白质都可以和亲合填料特异性结合，逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。

主要参考资料

[1] 林雪. 蛋白A的重组表达及重组菌的发酵过程优化[D]. 2010.

[2] 梁振东. 重组蛋白A亲和介质的制备及性能和应用研究[D]. 2015.

[3] 林乐懿. His-tag标记的嗜热菌来源L-脯氨酸脱氢酶的纯化与性质研究及生物感应器构建的研究[D]. 北京化工大学, 2010.