2-羟基柠檬酸的含量测定

背景及概述^[1][2]

2-羟基柠檬酸((-)-Hydroxycitric acid，(-)-HCA)存在于大量生长于印度次大陆和西斯里兰卡的某些藤黄果皮中，主要有Cambogia、Indica 和atroviridis藤黄。2-羟基柠檬酸，即1，2 -二羟基丙基-1，2，3 -三羧酸，具有二个不对称中心。因此，可能存在二对非对映体或四个不同的异构体。已经合成了2-羟基柠檬酸四个可能存在的立体异构体。2-羟基柠檬酸内酯的绝对构型经确定为(2S，3R)-2 -2-羟基柠檬酸-2，5-内酯。根据赫德逊内酯规则、旋光色散曲线、圆二色性曲线和偏摩尔旋光等计算可测定绝对构型。

利用X -射线晶体学测定了2-羟基柠檬酸钙和(-)-HCA 内酯的结构和绝对构型。2-羟基柠檬酸白色粉末，易溶于水，有实验显示，在多种HCA 异构体中，仅有(-)-HCA才具有生物活性。(-)-HCA的化学性质不稳定，在蒸发和浓缩时，易转化为更为稳定但不具有生物活性的内酯。因此，综合考虑稳定性和生理功能双方面因素，市售的藤黄（Cambogia）提取物商品，都是制成性质稳定且可被机体所利用并发挥生物功效的(-)-HCA 金属盐形式，如钠盐、钾盐和钙盐等。研究显示，(-)-HCA 不仅可抑制脂肪酸和脂肪的合成，还可减低食欲和摄食量，而最终起到减低体重的作用.

结构^[1，3]

(-)-2-羟基柠檬酸结构如下：

用途^[2]

(1)抑制柠檬酸裂合酶经线粒体催化为草酰乙酸和乙酰-CoA；

(2)影响脂肪酸合成和脂肪形成；

(3)影响生酮作用；

(4)降低食物摄入；

(5)可能促进糖原生成作用、糖原异生作用和脂类氧化作用；

(6)可作为体重控制剂；

 (-)-HCA 不会影响鼠脑突触体氧的消耗速率，不影响脂肪酸合成酶、肉碱乙酰转移酶、葡萄糖-6 -磷酸-脱氢酶和乙酰-CoA 合成酶的活性，但是抑制异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶和衣康酸水合酶(毫摩尔浓度)的活性。(-)-HCA 阻止地塞米松激活，胞苷酸转移酶，但不能阻止激活肺组织中的脂肪酸合成酶。目前国外已有14 种以上含有(-)-HCA 的药物上市，(-)-HCA 作为一种天然减肥药物日益得到消费者的关注。在我国以柠檬酸为原料，经脱水制取乌头酸，再由乌头酸氧化制取2-羟基柠檬酸，提供化学合成2-羟基柠檬酸的途径。我国有着丰富的中草药资源，发掘这一新型天然药物广阔前景，印度开发藤黄作为药物的成功为我国从事这一领域研究的科研人员提供了有益的经验。

测定^[2]

游离(-)-HCA 在浓缩和蒸发过程形成(-)-HCA 内酯。由于在藤黄果实中存在着柠檬酸、酒石酸和苹果酸等次要酸以及尚无检测(-)-HCA 的法定方法，导致分析结果混乱和不一致。目前测定Cambogia 藤黄提取物中(-)-HCA 含量的方法为酸碱滴定法，得到的是提取物总酸度。采用这一方法，不能分别测定(-)-HCA 及其内酯的浓度。采用气相色谱法测定了Cambogia藤黄果实中2-羟基柠檬酸含量。气相色谱法包括将有机酸转化为挥发性的甲硅烷化衍生物。他们使用OV -17 色谱柱(3m ×3mm 直径)，该柱于145 ℃使用氮气为载气(40ml/min)展开，注射口温度为250 ℃，检测器温度为300 ℃。(-)-HCA 内酯是该提取物中的主要成分，重结晶化合物中含有<0 .5 %杂质。气相色谱分析的衍生化———硅烷基化要求样品完全干燥，而(-)-HCA 在干燥时有内酯化趋势；此外(-)-HCA 为高度吸湿性，所以样品很难干燥，鉴于上述二个原因，采用气相色谱法无法测定游离(-)-HCA 含量。

近来，已经利用HPLC 法测定了Cambogia 藤黄果实、Cambogia 藤黄提取物的商品化样品和Indica 藤黄果皮和叶中的有机酸。在HPLC 法中，稀释提取物无需浓缩、干燥和衍生化就能定量测定，并且可分别定量测定(-)-HCA及其内酯含量。

制备 ^[3]

步骤1：乌头酸的制取将210 g 粉末状单结晶水的柠檬酸[ 1]，加入到98 %硫酸210 g 与105 mol 水配制的溶液中，加热至140 ～ 150 ℃，反应7 h，将棕色的液体倒入结晶皿，搅拌此液体冷却至40 ℃左右，抽滤收集固体，用10 ml 冰乙酸冲洗2 次，充分抽干倒入瓷盘中铺开，于40 ℃下鼓风干燥，粗品重116 g，熔点153 ～ 156 ℃变黑，用200 ml 冰乙酸精制得65 g，熔点163 ～ 166 ℃分解；用冰乙酸再精制一次得28.8 g，熔点185 ～ 186 ℃。

步骤2：柠檬酸的回收利用

上述反应液过滤出乌头酸后的母液，于10 ℃放置过夜，再将析出的固体过滤出来，用少量冰乙酸洗涤，烘干得51 g，熔点153 ℃。确定其为脱水柠檬酸，将192 g 脱水柠檬酸作为原料，经硫酸脱水制得乌头酸粗品75 g，熔点163 ～ 165 ℃，用冰乙酸精制一次得72 g，熔点175 ℃分解。

步骤3：2-羟基柠檬酸的合成

乌头酸17.4 g，溶于14 g 氢氧化钾与150 ml 水组成的溶液中。当溶液温度降至45 ℃，逐步加入氧化剂23 ～ 25 ml，温度控制在45 ～ 50 ℃之间反应22 h 。逐步加入少量亚硫酸氢钠，破坏剩余氧化剂，再加入约20 ml 浓盐酸酸化(pH ≈1)，将反应液过滤。滤液减压蒸馏至接近干，将适量无水乙醇分3 次加入后，过滤沉淀并合并醇液，减压蒸馏蒸去乙醇得12 g 产品，其熔点135 ～ 138 ℃变黄。

主要参考资料

[1] 2-羟基柠檬酸功能食品液相色谱检测

[2] 2-羟基柠檬酸的来源、制备方法和性质

[3] 柠檬酸的合成研究