磷脂酰乙醇胺的分离

概述^【1】

磷脂酰乙醇胺(phosphatidylerhanolamine，PE)又称脑磷脂，天然的磷脂酰乙醇胺是从动物脑组织或脊髓中用溶剂提取、精制而得；合成的磷脂酰乙醇胺是甘油单磷酸二脂肪酸酯与乙醇胺反应而得。目前尚无药典收载，我国生化试剂标准见表4—1—5。

药物制剂中的应用^【1】

磷脂酰乙醇胺在药剂中主要用作乳化剂和脂质体载体材料，用于制造乳剂和脂质体。此外，其还具有抗氧化作用，但由于价格较贵，故很少被用作抗氧剂。

磷脂酰乙醇胺的生物合成^【2】

磷脂酰乙醇胺的生物台成是从乙醇胺开始的．其+系列合成过程与磷脂酰腮碱的合成过程相对应．所不同的是各步反应所需的酶分别作相应的变化，由乙醇胺激酶(胞质)、CTP一磷酸乙醇胺胞苷酰转移酶(胞质)、CDP乙醇胺一1，2-二酰基甘‘油磷酸乙醇胺转移酶(内质网)催化(图9．7)。

目前．有关究竟是什么物质调节二二酰基日1油生成磷脂酰胚碱、磷脂酰乙醇胺或三酰基甘油还没有完全搞清楚。在肝细胞、酵母菌和某些细菌中发现存在着·条磷脂酰乙醇胺转换为磷脂酰胆碱的路线，在这条包括三个连续反应的路线中，甲基从S一腺苷甲硫氨酸(AdoMet)被转移到磷脂酰乙醇胺上，该转移过程是在位于内质网上的磷脂酰乙醇胺一N一甲基转移酶的催化下进行的。通过磷脂酰乙醇胺的甲基化，肝细胞实现磷脂酰胆碱与磷脂酰乙醇胺问的相互转化，并间接地产生胆碱。

在真核细胞中余下的四个主要磷脂由CDP二酰基甘油合成，其反应方式与磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的合成反应相似，如磷脂酰丝氨酸可通过由磷脂酰丝氨酸合成酶催化的CDP二酰基甘油与丝氨酸的反应得到，或由磷脂酰乙醇胺通过与丝氨酸的碱基交换反应得到，磷脂酰肌醇则可通过由磷脂酰肌醇合成酶催化的CDP二：酰基甘油与L一肌醇的反应得到等。

分离^【3】

单磷脂的功能13益为人们所认识，其用途也越来越广泛。比较经济实用的分离方法是溶剂法。溶剂法分离混合磷脂是根据混合磷脂中各组分在各种溶剂中的溶解性差异使之分离。早些时候主要是利用低级醇进行分离。混合磷脂中PC在低级醇中溶解度较大，而PE和PI在低级醇中溶解性较小，利用溶解性的差异，可以得到富含PC或PE的产品。其中在低级醇中PC与PE的比例可以从原料中的1：1提高到3：1以上，甚至可以达到12：1(即醇中含PC为61％，沉淀中含PE为50％)。

溶剂法分离磷脂混合物从其所用的溶剂及其他物质的不同，可以分为以下几种方式。

1．单一溶剂法

用一种溶剂进行抽提，可以得到富含某一组分的磷脂。最常用的溶剂是乙醇，因为它对PC比对PI的溶解度大，而PE的溶解度介于其中。影响磷脂各组分在溶剂中的溶解度的因素有水的含量、温度、溶剂的pH、调节pH所选的碱、酸。含水的乙醇可以改善PC的选择性，并且加入单甘酯可以进一步改善。M．Sosada等人研究了用乙醇做溶剂抽提菜油磷脂，磷脂中的PC含量从28％提高到58％。并作了条件实验。研究比较多的是从蛋黄磷脂中抽提得到富含PC的磷脂。重松康彦用异丙酮为溶剂，对氢化蛋黄磷脂中PC和PE进行分离。其工艺是通过热的溶剂对氢化卵磷脂溶解度的增加，而冷却后PC和PE在这种溶剂中的溶解度不同而将PC和PE加以分离。其氢化蛋黄磷脂中PC的含量可以从7，7，．2％提高到97．6％。

美国专利5，214，171用低碳醇抽提磷脂混合物，通过调节溶剂的pH来调节磷脂各组分在溶剂中的溶解度，从而将各组分分离开。在未调pH时，PC像报道的那样是可溶的，而PE的溶解度比PC低很多，PA几乎不溶；而降低pH，PC的溶解度只是轻微的增加，PE的溶解度下降很少，PA在pH小于5时溶解度增加很多，当pH小于3或2时其溶解度增加更多；PC在pH升到10或更高时溶解度增加很多，PE在pH升到大于8时，其溶解度大幅度上升，当pH上升到大于10(如10～11)PE溶解度上升4倍；而PI在醇中的溶解度不论是否调节pH都很低。调节pH所用的酸或碱应该是食品级的酸或碱，盐酸和氨水是最常用的酸和碱，它们价廉而且易于进行无水添加。另外，特定的碱对于特定的pH来说会影响某些磷脂的溶解度。比如用胆碱可以提高PC和PE的溶解度，特别是PE。

2．混合溶剂法

混合溶剂法是基于混合溶剂中的某一溶剂对磷脂的溶解度较大，而另外一种或几种溶剂对其中某些组分溶解度比较小，从而将不同溶解度的各单磷脂加以分离。常用的溶解磷脂的溶剂为非极性溶剂类，而用于萃取的溶剂有甲醇、乙醇、乙腈等。釜田二用己烷和醋酸做混合溶剂对蛋黄进行抽提。不同比例的溶剂萃取效果不同。PC含量可以从原料中的63．0％提高到73．0％，多次分离，PC的含量继续提高。用己烷、乙醇和水按比例不同对蛋黄磷脂进行抽提，可以得到富含PC或PE的产品。同时对不同浓度的乙醇对萃取效果的影响进行了研究。PC的含量(在溶剂中的磷脂)可以达到77．5％，PE在沉淀中的含量可以达到77．6％。

美国专利4，814，111基于乙腈对PC、PE的选择溶解性，即在室温下，PC在乙腈中有一定的溶解性，而PE在乙腈中不溶解。用乙腈一烷烃(如己烷)或乙腈一氟碳化合物体系对磷脂混合物进行抽提，PC被溶解在乙腈中，而PE则留在烷烃或氟碳化合物中，从而将两者分开。

3．无机盐络合法分离提纯大豆磷脂

此方法是依据无机盐和磷脂中的PE生成沉淀的性质，把PE从溶剂中分离出来，再用适量的溶剂萃取出无机盐，和其他的磷脂分离开来。许多水溶性或醇溶性的金属盐，如镁、锌、钙、镉、铝，都可以沉淀PE和PA，将PC留在醇溶液中。在食品和医药业中，只能用无毒的盐，常用的盐有硫酸镁、氯化镁、溴化镁。醋酸镁等，是硫酸镁。盐溶液可以用1～3个碳原子的脂肪族醇溶液，是甲醇和水。盐的用量(用无水盐来计算)，相对于磷脂原料的质量分数为1％～20％，是3％～8％，用量太多PC也会沉淀下来，用量太少PE等也会留在溶液中。早在1926年，瑞士专利No．127，256中就用CaCt：的醇溶液沉淀法制备磷脂，只是不能确定得到的磷脂是否带有杂质。

德国专利No．1070484，将丙酮脱油后的粗磷脂溶解于95％～100％的乙醇中，然后用MgSO。的甲醇／水溶液处理，于是PC被沉淀下来，实现了与PE的分离。l份的PC至少用0．5份(重量比)的MgSO；·7HzO来沉淀。当使用MgSO。甲醇溶液时会有沉淀生成，而使用水溶液时，会得到团状物并且加入丙酮它会更加固化。徐展采用ZnCl。沉淀卵磷脂，用乙醇后处理ZnCl。，研究了ZnCI。和乙醇浓度对纯度的影响。采用此无机盐复合沉淀法可有效地除去非磷脂类杂质以及脑磷脂等杂质。

4．酶法

磷脂酶D作用于磷脂，可以使其酶解生成磷脂酸，用乙醇胺代替磷脂中的极性部分，从而得到脑磷脂。将适量含磷脂酶D的活性酶加入到溶解了乙醇胺的缓冲剂中(缓冲剂为乙酸或磷酸，pH为5～7，其中溶解了CaCl。作为反应中介)，然后向反应器中加入适量的磷脂(缓冲剂的用量为3～6倍的磷脂数量)，反应在20一--50℃进行，搅拌5～24小时。酶解反应完成后，用水洗去反应中的副产品，如胆碱、反应中所用的酶和没有反应的乙醇胺等，得到高含量的PE。

美国专利200410235119AI制备脑磷脂的方法分两步：步，将原料磷脂混合物加入到水中，水作为反应媒介，其中含一种或两种二价的金属离子(如钙离子、镁离子、锌离子)，用磷脂酶D将磷脂水解生成磷脂酸；第二步，向反应体系中加入乙醇胺，生成所要的脑磷脂。  ．

5．乙酰化法

将PE通过酰化反应生成酰化磷脂，即APE。APE溶于丙酮，而PC不溶于丙酮，从而将两者分开。Marian Sosada等人将油菜籽磷脂中醇不溶部分(LElF，主要成分是PE、PI)在叔胺(嘧啶)存在的情况下，与乙酸酐反应，生成乙酰化磷脂APE，然后用丙酮溶解APE，从而将其他磷脂组分分离除去。同时采用全因素正交设计实验，研究了反应时间、嘧啶用量、温度对脑磷脂转化率(PECD)和乳化稳定性指数(ESI)的影响，使PECD和ESl分别增长了35％和60％。    ．

6．膜分离法

膜技术在精制植物油中的应用相对来说比较晚，分离磷脂开始于1977年，在最近几十年里发展迅速，并有大规模的应用。用膜技术来提取磷脂受到了人们的重视，已经有几种膜可供选择，其中一些是基于从油和己烷混合物中提取胶体；另一些是在没有有机溶剂的情况下直接从植物油中提取。在种情况下，主要的困难是膜在有机溶剂中的稳定性，后者则是油的粘度大，流量非常小。

Hancer M等学者研究了在非水介质中磷脂和大豆油在亲水和亲油的表面形成胶柬和吸附的机理，这对超滤分离磷脂有指导意义。诸多研究都把膜的抗污染能力、流量和磷脂的截留量作为指标，研究了膜的抗溶剂能力，其中聚酰亚胺被认为具有优秀的抗溶剂和耐高温的能力。Kim等研究了自制聚酰亚胺超滤膜的性能，试验表明这种膜有良好的抗溶剂能力，能有效截留磷酯，聚合的磷脂相对分子质量可达20 000。测量了膜的阻抗，表明凝胶体的阻抗大于膜本身的浓度差引起的阻抗，指出膜的污染应该包括孔的多层吸附和表面的污染。sengupta用己烷作介质，通过超滤膜从大豆油中除去磷脂，研究了几种超滤膜分离甘油三酸脂和磷脂的选择性。对用聚偏氟乙烯、聚砜醚和聚砜制取的四种膜进行了检测，认为除了膜的材料，孔径也是膜稳定的一个因素；渗透量在开始阶段急速下降是由于浓差极化和膜内部的污染引起的。试验结果表明聚偏氟乙烯在己烷中更稳定，开始阶段的流量下降比其他二者慢。Andras Koris的研究表明膜能有效制取磷脂，其中一种膜(称为Mavibran SPISA)当压力为0．15 MPa，温度为60℃，进料速度为0．13 rll3／h时，磷脂的收率能够达到70％～77％，通过添加少许水，截留量能够达到97％。

7．超临界二氧化碳萃取法

超临界流体萃取(简称SFE)技术是20世纪70年代兴起的一门新的分离技术，尤其是超临界CO：的应用，开辟了一个全新的研究领域，成为多学科交叉的热点，由于超临界二氧化碳萃取操作参数易于控制，极为适合处理热敏性的物质，可制得高品质的粉末磷脂。吕维忠等在国内率先研究了超临界Co。萃取法。他们采取正交试验，考虑萃取压力、温度和时间对萃取的影响。薄层分析结果表明，与化学溶剂萃取技术分离的磷脂结果基本上吻合。用超临界流体分离大豆卵磷脂，一般需加入夹带剂，这涉及到在超临界CO：和夹带剂混合体系中，磷脂和混合体系的热力学和动力学的问题。国外在这方面做了大量工作，认为超临界CO。溶解不同物质的能力可用色谱上的溶解度参数艿，理论来评估，溶解度参数从流体的状态效应和化学效应两方面进行描述。大豆磷脂中主要含有PI、PC和PE，经过对它们溶解参数的计算，理论上能进行分离，事实上也证明是可以分离的。汪勇等人进行了超临界萃取的工艺条件和动力学研究，将非稳态萃取分为恒速和降速阶段，采用一般的传质模型进行了动力学关联，引进了操作因子Ka，分析了固相物料中的油浓度和溶剂相中的油浓度的关系，模拟结果跟试验操作基本符合，指出温度和压力是主要因素，对工业化生产有重要意义。

磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)的合成^【4】

1．利用CDP一二脂酰甘油合成途径  在一些低等的真核生物及某些微生物体内，所有的甘油磷脂都是利用CDP一二脂酰甘油合成的。

2．利用CDP一乙醇胺合成途径在高等动、植物体内，乙醇胺在乙醇胺激酶催化下，利用ATP磷酸化生成磷酸乙醇胺，磷酸乙醇胺在CDP一磷酸乙醇胺胞苷转移酶催化下，与CTP反应生成CDP一乙醇胺；磷脂酸在磷酸酶催化下水解为二脂酰甘油；然后二脂酰甘油与CDP一乙醇胺在脂酰甘油转移酶催化下形成脑磷脂。

参考文献

[1]钱凯克  李亚南等编著,细胞生物化学原理,浙江大学出版社,1999年01月第1版,第193页

[2]姚静编,药用辅料应用指南,中国医药科技出版社,2011.08,第260页

[3]安红，宋伟明，张宏波编著,磷脂化学及应用技术,中国计量出版社,2006年06月第1版,第54页

[4]胡洪禄，王彬主编,生物化学,农业出版社,2006年7月,第94页