人生长激素生理作用及其制备

背景及概述^[1][2]

人类的生长激素(Growth hormone，GH)是一条单链、非糖化、191 个氨基酸组成的亲水性球蛋白，分子量21700Da，等电点pI 为4.9 。在53 位与165 位和182 位与189 位半胱氨酸残基间由二硫键相连；大约75 %垂体腺前叶嗜酸细胞分泌的生长激素是以此种分子结构形式分泌的，还有5 %～ 10 %是以分子量20kDa 形式分泌。hGH 构象中约有50 %α_螺旋，从三维结构看，hGH 包括四个反平行α_螺旋，其中三个α_螺旋起关键作用。分泌hGH 的细胞(在腺垂体的后外侧部)含圆形致密的分泌颗粒，直径约300~350nm 。hGH 属蛋白质激素，不通过靶腺产生生理效应，它的受体遍及全身。用125 Ⅰ标记的hGH 实验研究发现hGH 的受体在细胞膜上，肝、肾、脾、胰、肠、肾上腺皮质、心和骨骼肌的细胞表面都有较多的受体与125 Ⅰ_GH 结合。hGH 的作用机理一般认为是通过cAMP 进行的。在与靶细胞结合后，能改变氨基酸及代谢产物的运转，诱导某些特异性蛋白质和核酸的合成。

结构^[3]

人生长激素有两种基因-hGH-N 和hGH-V，分别编码蛋白hGH-N 和hGH-V。两者结构同源性达93 %，只有13 个残基不同。通常讲的hGH基因是指hGH-N，hGH 蛋白也是指hGH-N，它位于2.6Kb DNA 片段中，由5 个外显子和4 个内含子和3′及5′不翻译区(包括500bp 启动子区域)组成。而hGH-V 基主要在胎盘中表达，在胎儿和胎盘生长和发育中起作用。这两个基因都先翻译为激素原，然后通过酶水解加工成为具有生物活性的形式。

分泌

hGH 自发性分泌在昼夜间呈阵发性形式，一般发生在生理睡眠后第1 个慢波睡眠期(SWS)。白天休息时似能促进hGH 的释放，摄食、空腹、运动和应激可影响hGH 的分泌形式，但不改变其基础节律；青春期hGH分泌幅度高、频率快、昼夜分泌总量大，而老年人则相反。

生理作用及应用^[3]

1.人生长激素的促生长作用

人生长激素最明显的作用是促进骨、软骨和组织的生长，它刺激蛋白质和胶原的合成以及组织对循环系统中氨基酸的摄取和利用。人在幼年与成年时hGH的水平并无多大的差异(血清或血浆中检测的常规参考值为：成年男性<2μg/L ；成年女性<10μg/L ；儿童<20μg/L，但在人生长发育的幼年和育成期时，机体组织对hGH 更为敏感。hGH 对骨的促生长作用取决于骺软骨在成长中的状况。人与猫、犬、猪、牛及羊等动物一样，在幼年和育成期时GH 对四肢长骨生长有促进作用，故出生后至性成熟期先是体高增长加快，随后主要促进躯干脊柱的生长，此时体长的生长较为迅速，至成年时四肢和脊柱的生长已基本结束，但成年时躯干向宽度增长，雄性动物的胸宽、雌性动物的尻宽增大与性腺激素有密切关系。

hGH 对维持骨的延长虽属必要，但并非起直接作用。它是通过血中SM 或称硫酸化因子(Sulfation factor)来实现。这是一种肽类激素，分子量4000Da，能促进SO2 ^-4 、3H -胸苷、3H-尿苷和14C -亮氨酸进入软骨，增加胶原组织和蛋白质合成，促进软骨细胞、肝、肌肉和纤维母细胞的分裂。目前已纯化出3 种SM(A 、B、C)。SM-C 在促生长中较重要，它与SM -A 结构相似，为单链多肽，在血浆中有特异运载蛋白和抑制物的功能。SM-C 及其运载蛋白的含量受hGH 调控。

2.hGH 促进蛋白质合成

hGH 能促进氨基酸进入细胞，加速蛋白质的合成，减少尿素、肌酸和氮的排出，促使体内保持氮的动态平衡。在蛋白质的合成过程中，hGH 可加强tRNA 合成，促进氨基酸的摄取。嘌呤霉素不能阻断此效应，提示hGH 不是促进细胞内形成某种新蛋白质而是加强氨基酸的运转。胰岛素能促进氨基酸进入细胞，但要在hGH 存在时有此效应。

3.hGH 对脂肪和糖代谢的影响

hGH 能促使动物的脂肪分解，增加和抑制葡萄糖氧化，减少葡萄糖的消耗。hGH 对糖代谢作用较复杂。生理水平的hGH 可刺激胰岛素β 细胞，引起胰岛素分泌，加强葡萄糖的利用。过量的hGH 则抑制葡萄糖的利用。

4. hGH 对能量代谢的影响

hGH 具有稳定糖原的作用，能使正常动物在饥饿时骨骼肌保持糖原水平不变，心肌糖原水平还有所增加，从而有利于能量的储备，并有利于促使脂肪酸进入肝脏后在肝内氧化以提供能量，即可以使能量的来源由糖代谢向脂肪代谢转移，这对某些耐力运动是有利的。

制备^[4][1]

目前生产人生长激素主要是通过两种方法。一种是从人的尸体中摘取脑垂体做材料，进行人工提取，但不久就被证实在人体无活性。人脑垂体中生长激素的含量只占干重的4 %～ 8 %，从人的一个垂体中最理想的情况下也只能制得3~5mg 的生长激素。另一种是用基因工程方法生产。基因工程方法的生产也可分成两类：一类是在原核生物中生产，另一类是在真核细胞中生产。

hGH 的cDNA(或前体的cDNA)已可在细菌或哺乳动物细胞中表达，但由于hGH 没有糖链，用细菌表达不会存在由于无翻译后修饰造成影响，因此大部分研究者采用原核细胞系统表达。早在1979 年Goeddel 等就将hGH 的DNA 转录入大肠肝菌表达载体的lac 启动子末端，在带这个重组质粒的大肠杆菌中，得到N -端多一个Met 残基的重组人生长激素，其生物活性和天然产物相同。

虽然临床使用表明Met_rhGH 治疗效果和人垂体分离的hGH 相似，但Met_rhGH 在治疗过程中容易诱导较大的免疫反应，即使是高纯度Met_rhGH 制剂，仍有50 %～ 80 %病人会产生抗体，而使用人垂体hGH 制剂在临床上产生抗体的比例约为5 %～ 20 %，推测这个额外Met 与引起免疫反应有关。虽然高纯度Met_rhGH治疗后产生的抗体一般滴度较低，病人的生长速度不完全停止，但还是趋向应用N -端不带Met 的rhGH .用大肠杆菌生产无Met 的rhGH 有两种方法，一种是在胞内表达产生Met_rhGH 后，在加工、纯化过程中用酶法除去Met 分子；另一种方法是用分泌型载体，把hGH 成熟蛋白的编码序列直接转录入高表达高分泌启动子和信号序列后面，在分泌过程中切去信号肽，使表达的hGH 累积在细胞质中，其表达量可达细胞总蛋白的6 %~10 %，由这种载体表达的hGH 总量可达20.5mg/L，其中11.2mg/L 在胞外，8.6mg/L 在细胞周质，胞内只占0.7mg/L 。

除大肠肝菌外，目前用于临床的hGH 还可由芽孢杆菌系统表达，但以大肠杆菌系统表达占多数。美国的Genencor 和Genentech 公司采用枯草杆菌系统表达，他们详细比较了几种启动子、核糖体结合位点序列、转录终止子和宿主菌株，以化组合表达，hGH 产量可高达1.5g/L 。

测定

因为生长激素在体内代谢快，半衰期短，含量极微和排泄量少等特点，使得寻找一种理想的、能判断是否滥用了生长激素的检测方法十分困难。目前测定人生长激素的方法主要有放射免疫测定法(RIA)、免疫放射测定法(IRMA)、酶联免疫测定法(ELISA)、时间分辨荧光免疫分析法(TRIFMA)和生物检定法等多种，以RIA和ELISA 法应用较广。

1）放射免疫测定法(RIA)：可测出尿、体液和组织提取物中微量GH。其测试原理为：GH 抗原与定量同位素标记抗原一起与限量专一抗体发生竞争性结合，反应平衡后，测沉淀物中cpm，根据标准曲线计算出未知样品含量。在腺垂体中GH 的含量约为垂体干重的4 %～ 8 %，即含3~5mg，似无年龄差异。正常人血浆GH含量为1~5ng/ml，饭后3~4h 略有升高，深睡后1h GH明显升高，且持续时间达2~3h，GH 在血浆中半衰期为20~25min 。其检测灵敏度为200ng/L。

2）酶联免疫测定法(ELISA)：是针对hGH 不同抗原决定簇的两株单克隆抗体，建立双抗体夹心ELISA 法测定血清hGH。其检测灵敏度为1ng/L。成人参考值0.5~5ng/ml。

3）时间分辨荧光免疫分析法：测定原理是用鼠抗hGH 单克隆抗体(mAb)包被固相载体，加入hGH 标准液或待测样品(抗原)与固相载体结合，洗去无关成分后，加入铕(Eu3 +)标记的鼠抗hGH mAb，反应后洗去无关成分，加入荧光增强液，最后测荧光强度。

4）生物检定法：胫骨试验是经典的试验法，即对去垂体动物投给测试激素样品，2~3 周后测量胫骨近端骺软骨增加的宽度。该法可测出巨人症、肢端肥大症及胰岛素所致低血糖时血浆中高GH 水平，但不能测出正常人血中的GH 水平。另一种方法是测定体重的增加和氮潴留的增加来确定GH 。另外，根据目前的研究，设法追踪与生长激素相关的生长素介质，可能为检测生长激素寻找到一个突破口。其原理为：正常人的血清中IGF_Ⅰ 和IGF_Ⅱ 的浓度远远高于生长激素的浓度。

如果正常人或垂体功能低下的人使用了生长激素，则会使血清中IGF_Ⅰ 增高，而且这一作用在生长激素作用消失后还将延续一段时间，因为IGF_Ⅰ的合成和代谢清除都比较缓慢。因此，可以用测定IGF_I 和IGF -Ⅱ与生长激素浓度的比值来间接地判断人生长激素在血浆中含量的变化，从而推测是否滥用了生长激素。但该方法目前仅仅停留在理论研究阶段，实际操作的方法尚未确定，且至少还有一些具体问题需要解决，比如正常人和从事高强度运动的运动员的常规值水平需要确定等等。

主要参考资料

[1] 王德芬，王伟主编.生长激素与生长激素治疗[ M] .上海：上海科学技术文献出版社，1998 .

[2] 陈蓓, 朱威. 人生长激素研究进展[J]. 生物学杂志, 2004, 21(1): 9-11.