蜂毒肽的作用

背景及概述^[1][2]

蜂毒是工蜂毒腺分泌的一种具有芳香气味的透明液体，主要由多肽类、活性酶类、非肽类物质组成，蛋白质多肽类物质是蜂毒中的主要成分，约占蜂毒的70%-80%。蜂毒肽是由26个氨基酸残基组成的多肽，分子量为2840Da，约占蜂毒干重的50%，其一级结构氨基酸残基序列为NH₂-Gly-Ile-Gly-Ala-Val- Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Glu-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Glu-Gln-COOH。

蜂毒肽具有抗炎、抑菌、抗癌、抗 辐射、抑制血小板凝集等作用，可有效地治疗肩周炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎等多种疾病，在医药领域具有一定的应用。蜂毒肽是从蜂毒中分离纯化得来的，具有生物活性高、不污染环境等特点，可以研制开发出机体免疫调节剂等产品，具有很大的市场开发前景，因而引起了学术界广泛的关注。

制备^[1]

用溶媒萃取、三柱层析、溶媒萃取与三柱层析相结合等方法制备蜂毒肽，其产品制 备过程繁琐，生产周期较长，有机溶剂使用量大。Kreil报道了溶媒萃取制备蜂毒肽的方法，蜂毒肽得率约为20%（质量分数），纯度 在60.3%（质量分数），制备方法简便，提取1g蜂毒肽需要200mL正丁醇，正丁醇的需求量大，造成环境的严重污染。

刘岭和杨文超报道了三柱层析法制备蜂毒肽，蜂毒 肽得率约为48.67%（质量分数），纯度为97.32%（质量分数），纯度较高，解决了有机溶剂用量 大的问题，但是提取过程复杂，提取时间较长。张文礼和徐彭报道了溶媒萃取与层析法相结合制备蜂毒肽，蜂毒肽得率约为47%（质量分数），纯度为电泳纯，缩短了三柱层析法所需时间，与Kreil的制备方法相比较，减少了正丁醇的使用量，但在提取过程中仍需大量的正丁醇，不利于环境保护。

上述分离纯化方法生产工艺复杂，生产周期长，得率低，纯度低，且污染严重。CN201710169095.3提供一种快速制备蜂毒肽的方法，该方法所制备的蜂毒肽，得率高，纯度高，周期短，能耗低，污染小的制备蜂毒肽的方法。

本发明获得蜂毒肽的提取率质量分数为49%，纯度质量分数为98%。本发明的一种制备蜂毒肽的方法，步骤如下：

①蜂毒的除杂将粗蜂毒加入到pH为4.0-5.5的缓冲溶液中，使其浓度为0.5-1.5mg/mL，以2500- 3500r/min离心3-7min去除不溶性的杂质，得上清液；所述粗蜂毒是将蜜蜂蛰刺排出的毒液用蒸馏水溶解，经冷冻干燥所得；所述缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲溶液；所述除杂为除去不溶于缓冲溶液的物质。

②蜂毒肽的分离将①中所得上清液过葡聚糖凝胶G-25柱，用蒸馏水洗脱，流速控制在25-30mL/h，测定各分离组分的分子量，在葡聚糖凝胶柱下收集分子量为2840Da的层析组分经冷冻干燥得固体样品。采用本方法生产蜂毒肽，简化了蜂毒肽的提取工艺，与现有方法相比生产周期减少1-2天，得率提高1-2%，降低了制备成本，蜂毒肽纯度可达到电泳纯。

药理作用^[2]

1 直接杀伤肿瘤细胞

蜂毒肽作为单体在中性水溶液中是以随机的卷曲结构存在的，而随着 pH 值以及离子强度的增高，蜂毒肽自我交联， 形成螺旋的四聚体结构。有研究发现在不同的溶液中蜂毒肽的螺旋结构区域及螺旋间的角度是不同的。螺旋结构中螺旋的表面是前21 个极性的氨基酸，螺旋的另一面是非极性氨基酸。这个两亲性是膜结合肽和膜蛋白跨膜螺旋的特征。

这个特征决定了蜂毒肽容易融入和破坏天然的和合成的磷脂双分子层，从而抑制细胞生长发育，对肿瘤细胞有强烈的细胞毒素作用。因为蜂毒肽是破坏细胞膜而导致细胞的死亡， 所以它不用进入细胞， 在细胞外即可显示出其破坏肿瘤细胞毒性。郭炬等学者在研究蜂毒肽对 LNcap 细胞的抑制作用中，发现蜂毒肽对 LNcap 细胞有很强的抑制作用，且蜂毒肽的浓度越高对癌细胞的抑制率越高。

2 诱导肿瘤细胞凋亡

细胞凋亡是一个细胞自杀程序，包含一系列形态学和生物化学的变化，绝大多数疾病的发病机理与细胞凋亡有关。诱导细胞凋亡的途径主要有内质网途径( 如Ca^{2 +}通道的影响) ，线粒体凋亡途径，死亡受体途径和其他因素( 如肿瘤细胞的放射敏感性) 。

2.1 Ca^{2 +} 通道的影响

当 Ca^{2 +} 从内质网中被释放进入细胞质后会激活内质网附近的 calpain， 然 后作用于胱天蛋白酶12( caspases-12) 使之活化并释放入细胞质，从而诱导细胞凋亡。蜂毒肽能够增加细胞膜对离子的渗透能力，尤其是 Na⁺和Ca²⁺ 。Ca²⁺ 可以携带信号激活细胞来执行其程序功能。

SARIS研究发现钙超载可以诱导细胞凋亡， 并且是由多种细胞建立起来的。CHU等研究发现蜂毒素在人骨瘤细胞 MG63 中能够通过 L 型 Ca²⁺ 通道诱导 Ca²⁺ 内流，使细胞内 Ca²⁺ 浓度升高，导致细胞裂解从而引起 MG63 细胞凋亡，而且Ca²⁺内流不依赖于蛋白激酶 C 和磷脂酶 A2 的活性。

2.2 线粒体凋亡途径

细胞凋亡调控的活动中心是线粒体，线粒体在凋亡因子的刺激下释放出细胞色素 C 等促凋亡因子，促凋亡因子再激活细胞内凋亡蛋白酶 caspases，活化后的 caspases 又反过来作用于线粒体，促进其释放细胞色素 C。Bcl- 2 家族蛋白可以调节线粒体通透性转换孔，进而调节细胞色素 C 从线粒体释放到胞浆，并且在细胞凋亡调控中起关键作用。

李玉梅等研究发现，蜂毒素能够诱导 U2OS 细胞凋亡，并且可以促使 U2OS 细胞抗凋亡蛋白Bcl- 2及 Bax 蛋白表达发生变化，Bax /Bcl-2 比率变化，先激活 caspases- 9，再激活 caspases- 3，最后诱导细胞发生凋亡。张晨用不同浓度的蜂毒素处理 BEL- 7402 细胞后，细胞线粒体膜蛋白 7A6 表达率均有所上升，且表达率随着蜂毒素浓度的升高而升高， 对肝癌细胞凋亡具有促进作用。

2.3 死亡受体途径

死亡受体介导细胞凋亡的途径主要是通过跨膜受体将信号从胞外传到胞内， 衔接蛋白和受体结合后，执行蛋白再与衔接蛋白结合，从而诱导细胞凋亡。其途径主要包括活化诱导的肿瘤坏死因子受体、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体( TNF-related apoptosisinducing ligand， TRAIL) 和 FAS /FASL。张晨用蜂毒素处理 BEL-7402 细胞后，根据 RT-PCR 扩增结果发现蜂毒素对细胞凋亡相关的 Fas 蛋白产生影响， 初步认为蜂毒素对 BEL- 7402 细胞的诱导凋亡与 Fas 蛋白表达有关。

汪晨等学者通过构建小鼠荷瘤模型发现蜂毒素可以促进人肝癌细胞对 TRAIL 的敏感性，能够通过增强激活钙 /钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ-转化生长因子β活化激酶 1-促分裂原活化的蛋白激酶激酶-JNK/p38 信号通路并抑制核因子κB 抑制蛋白激酶-核因子 κB 信号通路的方式协同 TRAIL 诱导人肝癌细胞的凋亡。

2.4 提高肿瘤细胞的放射敏感性

放射治疗和化疗是治疗肿瘤的重要手段。一般来说，肿瘤放射性治疗的效果和放射敏感性有关，即放射敏感性强的治疗效果好，放射性敏感差的治疗效果差。国外学者研究发现蜂毒肽可以增强食管癌的放射敏感性， 导致其在体外和体内的凋亡作用增强。学者认为蜂毒肽和辐射诱导的细胞凋亡可能是通过 Bax /Bcl- 2 途径激活， 因而得出蜂毒肽介导的放射增敏作用可能部分是由于Bcl- 2 蛋白的调节。

杨曦对鼻咽癌 CNE- 2 细胞接受不同剂量的 X 线放射后，发现联用蜂毒肽后的常氧组和乏氧组较之前的细胞存活分数值均有显著降低。蜂毒肽在 CNE- 2 常氧和乏氧细胞中的增敏比分别为 1.07 和 1.13，并且蜂毒肽能够增加常氧和乏氧 CNE- 2 细胞照射后的细胞总凋亡率。因此，蜂毒肽可以有效地提高肿瘤细胞的放射敏感性，促进肿瘤细胞的诱导凋亡。

3 抑制肿瘤细胞的侵袭和转移

血管是肿瘤细胞侵袭和转移的重要渠道之一，肿瘤细胞可以通过血管流向全身各处。因此，我们可以通过抑制肿瘤相关血管的生成来抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。国外学者研究发现蜂毒肽能够抑制血管内皮生长因子 A 诱导 Lewis 肺癌体内肿瘤的生长和肿瘤相关血管的生成，而且这种抑制血管内皮生长因子 A 诱导增殖和毛细分化没有细胞毒性，与血管内皮生长因子 2 和环氧化酶- 2通过促分裂原活化的蛋白激酶信号通路有关。侵袭和转移的生物学过程中需要破坏细胞外基质。

因此，细胞外基质降解化酶如基质金属蛋白酶成为了肿瘤侵袭转移调控的重要药物靶标。PARK研究表明蜂毒肽可以通过抑制基质金属蛋白酶- 9 表达来抑制佛波酯刺激的癌细胞侵袭，而基质金属蛋白酶- 9 表达的抑制是由于蜂毒肽抑制磷酸化细胞外调节蛋白激酶( extracellular regulated protein kinase， ERK) 和磷酸化 Jun 水平导致影响了 AP- 1 和核因子κB。

从而表明，蜂毒肽可以通过防止细胞外基质的降解来抑制癌细胞的侵袭和转移。LIU研究表明 Rac1 是体内和体外肝癌细胞转移的关键调节剂。Jun 通路是 Rac1 依赖通路之一，而蜂毒素可以通过抑制 Jun 通路很大程度上抑制细胞的运动，从而防止体内肝癌细胞的转移。

4 免疫调节作用

T 细胞调节是人体内细胞免疫调节的重要部分，在 T 细胞调节中存在一个重要的平衡即辅助性 T 细胞 1( helper T cell，Th1)/Th2 平衡，Th1 细胞分泌的γ-干扰素具有抗肿瘤作用，而 Th2 细胞分泌的白细胞介素- 4( interleukin，IL- 4) 具有促进炎症作用。如果使Th1 /Th2 平衡向 Th1 倾斜，就可以提高 T 细胞的抗肿瘤作用。

NAM等研究发现蜂毒可以通过上调 Tbet 选择性的诱导 Th1 细胞谱系的发展，增加 Th1 细胞的特异性细胞因子 γ-干扰素的表达。而且这种作用是通过直接影响 CD4 + T 细胞介导的，不依赖于任何抗原呈递细胞。

王秋波在对志愿者的蜂疗后发现机体的 IL- 2 含量明显升高，IL- 4 含量降低，导致Th1 细胞功能的增强，对机体细胞免疫功能起正向调节的作用。熊浪平等学者通过小鼠实验发现蜂毒肽在免疫细胞激活的状态下可以上调 Th1 比例和γ-干扰素浓度，下调 IL- 4 浓度对免疫细胞产生影响，从而可以提高抗肿瘤作用。

主要参考资料

[1] CN201710169095.3 一种制备蜂毒肽的方法

[2] [1]王智传,陈琪,刘欣,谢相红,姜小凡,朱文赫.蜂毒肽抗肿瘤作用机制研究进展[J].吉林医药学院学报,2018,39(06):462-464.