大鼠D-乳酸(D-LA)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠D-乳酸(D-LA)ELISA试剂盒用于测定大鼠血清，血浆,组织及相关液体样本中D-乳酸(D-LA)的含量。

实验原理：

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠D-乳酸(D-LA)水平。用纯化的大鼠D-乳酸(D-LA)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入D-乳酸(D-LA)，再与HRP标记的D-乳酸(D-LA)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠D-乳酸(D-LA)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠D-乳酸(D-LA)浓度。

大鼠D-乳酸(D-LA)ELISA试剂盒

操作步骤：

1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。

4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5．每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。

8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9．在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于丙酮酸钠与PD-2液腹腔复苏对失血性休克大鼠肠粘膜屏障功能保护作用的实验研究

比较丙酮酸钠与PD-2液腹腔复苏对失血性体克大鼠肠粘膜屏障的保护作用,从血清学、形态学及蛋白质水平探讨丙酮酸钠腹腔复苏对失血性休克大鼠肠粘膜屏障功能的保护作用及其在腹腔复苏中的优势。

方法：健康清洁级雄性SD大鼠,40只,随机分为4组：假手术组（对照组）、失血性休克模型组（休克组）,复方氯化钠（林格氏液）静脉复苏+PD-2液腹腔复苏组（PD-2液组）,复方氯化钠（林格氏液）静脉复苏+丙酮酸钠腹腔复苏组（丙酮酸钠组）,每组10只。对照组依次行右颈总动脉、右股静脉、左股动脉插管及全身肝素化。休克组在对照组基础上经左股动脉放血,制备失血性休克大鼠模型。PD-2液组、丙酮酸钠组在休克组基础上经右股静脉复苏,复苏液体为放出的血量及2倍量的林格氏液。同时分别向腹腔内注入20ml2.5%PD-2液与20ml丙酮酸钠。对照组大鼠插管后2h取材（动脉血与小肠标本）待测；休克组大鼠造模后1h取材；PD-2液组、丙酮酸钠组大鼠复苏后1h取材。保持大鼠自由通畅呼吸,用烤灯维持大鼠体温在37±0.3℃。在实验设计时间取左股动脉血,以自动血气分析系统测定动脉血气（pH、PaCO2、PaO2）。

采用分光光度法测定血浆D-乳酸（D-lactic acid,D-LA）含量,光镜下观察各组大鼠小肠粘膜组织形态改变。用免疫印迹法和免疫组织化学方法测定小肠粘膜上皮磷酸化血管扩张刺激磷蛋白（p-VASP）及下游紧密连接结构蛋白ZO-1的表达情况。

结果：血气分析结果：休克组pH及Pa02水平较对照组明显降低,差异有统计学意义（P<0.01）,PaCO2降低,差异无统计学意义（P>0.05）；PD-2液组、丙酮酸钠组较休克组pH水平及Pa02含量明显升高,差异有统计学意义（P<0.01）,PCO2升高,差异无统计学意义（P>0.05）,与PD-2液组比较,丙酮酸钠组pH水平及P02水平升高更为明显,二组间差异有统计学意义（P<0.05）；PCO2变化差异无统计学意义（P>0.05）。D-LA含量结果：较对照组比较,休克组D-LA含量明显升高,差异有统计学意义（P<0.01）；PD-2液组、丙酮酸钠组较休克组明显降低,差异有统计学意义（P<0.01）；与PD-2液组比较,丙酮酸钠组D-LA降低更明显,二组间差异有统计学意义（P<0.05）。

光镜下对照组大鼠小肠粘膜层绒毛排列整齐,无水肿,粘膜下血管充盈。休克组大鼠小肠粘膜层绒毛高度水肿,粘膜下血管塌陷,固有层内腺体灶性区域坏死,并大片粘膜绒毛坏死、脱落,缺损；PD-2液组和丙酮酸钠组小肠粘膜破坏较休克组明显减轻,见小肠粘膜层绒毛轻度水肿、少量片状坏死、脱落,粘膜下血管轻度塌陷；丙酮酸钠组大鼠小肠粘膜绒毛水肿、倒伏及坏死程度均好于PD-2液组,粘膜下血管较充盈。

小肠上皮损伤指数评分：丙酮酸钠组高于休克组及PD-2液组（P<0.01or P<0.05）。蛋白质免疫印迹结果显示休克组、PD-2液组、丙酮酸钠组大鼠小肠粘膜ZO-1蛋白水平较对照组低（P<.01）,p-VASP蛋白水平均较对照组高（P<0.01）；与休克组相比较,PD-2液组、丙酮酸钠组大鼠小肠粘膜ZO-1蛋白含量均增高（P<0.01）,p-VASP蛋白含量均降低（P<0.01）,其中丙酮酸钠组小肠粘膜ZO-1蛋白含量增高更明显（P<0.05）,p-VASP蛋白表达降低更明显（P<0.05）;而丙酮酸钠组与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。免疫组化结果显示各组结果与免疫印迹基本一致。

参考文献

[1]The Effects of 6%Hydroxyethyl Starch–Hypertonic Saline in Resuscitation of Dogs with Hemorrhagic Shock[J].Anesthesia&Analgesia.2011(2)

[2]17β-ESTRADIOL MEDIATED PROTECTION AGAINST VASCULAR LEAK AFTER HEMORRHAGIC SHOCK:ROLE OF ESTROGEN RECEPTORS AND APOPTOTIC SIGNALING[J].Ed W.Childs,Binu Tharakan,Felicia A.Hunter,W.Roy Smythe.Shock.2010(3)

[3]HYPERTONIC SODIUM PYRUVATE SOLUTION IS MORE EFFECTIVE THAN RINGER’S ETHYL PYRUVATE IN THE TREATMENT OF HEMORRHAGIC SHOCK[J].Pushpa Sharma,Paul D.Mongan.Shock.2010(5)

[4]Ena/VASP:towards resolving a pointed controversy at the barbed end.[J].Bear James E,Gertler Frank B.Journal of cell science.2009(Pt 1)

[5]王小周.丙酮酸钠与PD-2液腹腔复苏对失血性休克大鼠肠粘膜屏障功能保护作用的实验研究[D].遵义医学院,2012.