人P53(P53)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人P53(P53)ELISA试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中P53（P53）含量。

实验原理:

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人P53水平。用纯化的人P53抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入P53，再与HRP标记的P53抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的P53呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人P53浓度。

人P53(P53)ELISA试剂盒

标本要求

1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤

实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100μl（取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

4.每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液）100μl，37℃，60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15分钟以内进行检测。

应用^[4][5]

用于头颈部鳞癌HPV E6/E7 mRNA与p16蛋白、p53蛋白表达的初步研究

目的：（1）研究HNSCC组织中HPV E6/E7mRNA的表达情况；

（2）探讨HNSCC组织中HPV E6/E7mRNA与p16蛋白、p53蛋白表达的相关性；

（3）评价HPV感染、p16蛋白、p53蛋白表达对HNSCC预后的影响。方法：回顾性分析在2010.01～2012.06期间在河南省肿瘤医院收治的符合纳入标准的30例HNSCC患者的临床病理资料，并随访生存时间。应用分支DNA（branch-DNA，b-DNA）技术检测30例肿瘤组织HPV E6/E7mRNA；应用免疫组化方法（immunohistochemistry，IHC）检测其p16蛋白、p53蛋白的表达情况。SPSS17.0软件统计分析HPV E6/E7mRNA、p16蛋白、p53蛋白表达与各临床指标之间的相关性，及影响预后的因素。

结果：

（1）30例HNSCC患者的肿瘤组织中HPV E6/E7mRNA的检出率为26.7%。

（2）30例HNSCC患者中，20.0%患者组织中有p16蛋白过表达，43.3%患者组织中有p53蛋白低表达。

（3）HPV E6/E7mRNA的检出在吸烟饮酒、性别、年龄中的差异无统计学意义（p＞0.05）。

（4）HPV阳性与p16蛋白正相关（r=0.829，p=0.000），与p53蛋白负相关（r=-0.690，p=0.000）。p16蛋白与p53蛋白负相关（r=-0.472，p=0.008）。HPV阳性组和阴性组的2年生存率分别为75.0%和45.0%，差异有统计学意义。p16蛋白阳性组与阴性组的2年生存率分别为83.3%和45.5%，差异有统计学意义。p53蛋白阳性组与阴性组的2年生存率分别为37.5%和75.0%，差异有统计学意义。

（5）30例HNSCC患者，术后随访，中位随访时间为24个月。单因素Kaplan-Meier法生存分析结果显示，HPV感染状况、p16蛋白、p53蛋白对患者预后影响有统计学意义（p＜0.05）。多因素COX回归模型分析，p16蛋白是影响患者预后的主要危险因素。

参考文献

[1]Human papilloma virus testing in oropharyngeal squamous cell carcinoma:What the clinician should know[J].Ha?tham Mirghani,Furrat Amen,Frederique Moreau,Joel Guigay,Malek Ferchiou,Antoine E Melkane,Dana M.Hartl,Jean Lacau St Guily.Oral Oncology.2014(1)

[2]P53 immunohistochemical expression does not correlate with clinical features in 207 carcinomas of the oral cavity and in the head and neck region[J].Alexander Gr?be,Henning Hanken,Ahmed Al-Dam,Georg Cachovan,Ralf Smeets,Antje Krohn,Till Clauditz,Tobias Grob,Ronald Simon,Guido Sauter,Lan Kluwe,Max Heiland,Marco Blessmann.Clinical Oral Investigations.2014(1)

[3]Increasing prevalence rates of HPV attributable oropharyngeal squamous cell carcinomas in the Netherlands as assessed by a validated test algorithm[J].Michelle M.Rietbergen,C.RenéLeemans,Elisabeth Bloemena,Dani?lle A.M.Heideman,Boudewijn J.M.Braakhuis,Albertus T.Hesselink,Birgit I.Witte,Robert J.Baatenburg de Jong,Chris J.L.M.Meijer,Peter J.F.Snijders,Ruud H.Brakenhoff.Int.J.Cancer.2012(7)

[4]Detection of Human Papillomavirus in Clinical Samples[J].William H.Westra.Otolaryngologic Clinics of North America.2012(4)

[5]王宁宁.头颈部鳞癌HPV E6/E7 mRNA与p16蛋白、p53蛋白表达的初步研究[D].郑州大学,2014.