人集落刺激因子(CSF)ELISA 试剂盒的应用

背景^[1-3]

人集落刺激因子(CSF)ELISA试剂盒采用夹心法酶联免疫吸附法，用于体外定量分析人血清、血浆、细胞裂解液、细胞培养上清中CSF的含量。

检测原理：

预先包被的抗体和检测相抗体都是CSF3多克隆抗体。检测相抗体经生物素标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人CSF3呈正相关。

人集落刺激因子(CSF)ELISA试剂盒

G-CSF是一个对粒细胞系列的生长、分化、激活有特异作用的多功能因子。单核细胞和巨噬细胞受刺激后合成该蛋白。人G-CSF合成时有208个氨基酸，含30个氨基酸的引导肽，成熟蛋白175个氨基酸。本试剂盒所用的标准品为重组人CSF3，175个氨基酸，分子量18.8KDa。

操作程序：

1、已稀释好的ABC和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡30分钟。试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。每次检测都应该做标准曲线。用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数。

2、确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。总数=样品数+9；做双份检测时×2。其余重包装好放入冰箱中。

将2000pg/ml,1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml的标准品各100μL依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。对于人血清、血浆、细胞裂解液、细胞培养上清，直接加已用样品稀释液稀释的样品100μL。酶标板加封板膜，37℃反应90分钟。

3、反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。不洗。

4、将准备好的生物素抗人G-CSF抗体工作液按每孔100μL依次加入（TMB空白显色孔除外）。

5、酶标板加封板膜37℃反应60分钟。

6、1X洗涤缓冲液洗涤3次，每次浸泡1分钟左右（每孔洗液至少300μL）。

7、将准备好的ABC工作液按每孔100μL依次加入（TMB空白显色孔除外）。

8、酶标板加封板膜37℃反应30分钟。

9、1X洗涤缓冲液洗涤5次，每次浸泡1～2分钟左右（每孔洗液至少300μL）。

10、按每孔90μL依次加入TMB显色液，37℃避光反应15～20分钟。

11、按每孔100μL依次加入终止液，此时蓝色立转黄色。用酶标仪在450nm测定O.D.值。

应用^[4][5]

用于BCL10调控粒—巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）转录水平的研究

成熟hG-CSF含有174个氨基酸残基；根据宿主菌的密码子偏爱性,将人源基因按照宿主密码子偏爱性进行全面优化,并在基因5’上游添加限制性内切酶位点、起始密码子、His-Tag、蛋白酶位点,在基因3’下游添加终止子密码、限制性内切酶位点,拟合成序列全长为597bp,再利用GeneDesign 3.0将拟合成的序列拆分为16条单链寡核苷酸,化学合成后应用两步法进行序列拼接成全长序列。

同时利用RT-PCR技术钓取人源G-CSF基因,与化学合成基因按照同样方法克隆到pET23a中,构建表达载体pET-sCSF。将二者转化到含有增强表达效果的E.coli BL21（DE3）宿主中,分别构建成E.coli sCSF、和E.coli hCSF表达菌株。进一步考察IPTG诱导起始时间、诱导持续时间、诱导浓度、培养温度对G-CSF表达量及其在细胞总蛋白所占比重的影响。

外源基因表达的最适条件为,接种后37℃培养6h,加入终浓度为40μmol/ml的IPTG,继续诱导培养6h,收获菌体,超声破碎后进行相关检测。合成基因将人源基因中编码Leu的2个CTA、编码Pro的10个CCC、编码Cys的1个TGT、编码Arg的1个AGG的密码子用大肠杆菌细胞内丰沛的密码子CTG、CCG、TGC、CGT替代,外源蛋白的表达量增加21.9%,在菌体中所占比例增加17.2%。且表达的目的蛋白主要以可溶形式存在（90.9%）,占上清液总蛋白含量的35.2%。

参考文献

[1]Simplified gene synthesis:A one-step approach to PCR-based gene construction[J].Gang Wu,Julie B.Wolf,Ameer F.Ibrahim,Stephanie Vadasz,Muditha Gunasinghe,Stephen J.Freeland.Journal of Biotechnology.2006(3)

[2]Codon Usage Domains over Bacterial Chromosomes[J].Marc Bailly-Bechet,Antoine Danchin,Mudassar Iqbal,Matteo Marsili,Massimo Vergassola.PLOS Computational Biology.2006(4)

[3]Splicing by overlap extension by PCR using asymmetric amplification:an improved technique for the generation of hybrid proteins of immunological interest[J].Anthony N Warrens,Michael D Jones,Robert I Lechler.Gene.1997(1)

[4]Extracellular Domain of Granulocyte-Colony Stimulating Factor Receptor[J].Mitsuru Haniu,Thomas Horan,Tsutomu Arakawa,John Le,Viswanatham Katta,Michael F.Rohde.Archives of Biochemistry and Biophysics.1995(2)

[5]付瑶.人粒细胞集落刺激因子的基因合成、原核表达与活性研究[D].吉林大学,2011.