大鼠肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法（ELISA）特异性的检测样本中肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)的含量。

实验原理

大鼠肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大鼠肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

大鼠肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)ELISA试剂盒

样本处理要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

用于高氧肺损伤新生大鼠肺组织中肺表面活性物质相关蛋白-A（SP-A）的mRNA和蛋白表达及布地奈德的干预作用研究

1．建立新生大鼠高氧肺损伤的动物模型；

2．观察与比较高氧性损伤时新生大鼠肺组织的病理组织学改变，以及肺表面活性物质相关蛋白-A（pulmonary surfactant protein-A，SP-A）的mRNA及其蛋白的表达变化，从而探讨SP-A在新生大鼠高氧肺损伤发生、发展中可能的作用；

3．探讨吸入性糖皮质激素布地奈德（budesonide，BUD）是否通过调控SP-A的表达从而发挥对高氧肺损伤的保护作用，为临床防治高氧肺损伤提供理论依据。

方法：取108只出生1天内的新生Sprague Dawley（SD）大鼠（雌雄不限）随机分成三组：即Ⅰ组：空气组（对照组），Ⅱ组：高氧＋生理盐水组（高氧组），Ⅲ组：高氧＋布地奈德组（干预组），每组36只。Ⅰ组置于空气中；将Ⅱ、Ⅲ组实验动物持续暴露于90％～95％氧箱中，直至实验结束。Ⅱ组于每日雾化吸入NS10ml，Ⅲ组每日同一时间点吸入溶解BUD的等量的NS（含BUD2mg）。设立实验后3、7和14天3个时间观测点，处死动物，行支气管肺泡灌洗，测定灌洗液中蛋白含量；取肺组织，计算肺湿/干重比；HE染色观察组织病理学变化；Westen Blot方法检测SP-A蛋白含量、RT-PCR方法检测SP-A mRNA表达水平。结果：1．各组实验动物一般情况：Ⅰ组（空气组）中的实验动物在实验期间精神状态佳、活动灵活，进食正常。Ⅱ组（高氧组）中的实验动物逐渐出现症状，表现皮毛无光泽、精神萎靡、活动少,脱氧后烦躁不安,呼吸困难明显,鼻尖发绀,恢复供氧可逐渐缓解；Ⅲ组（干预组）中的实验动物情况介于前两者之间。

2．肺组织病理切片：Ⅰ组（空气组）实验动物肺组织病理切片见肺组织结构规整，无炎症反应，肺泡大小、形态均一；Ⅱ组（高氧组）高氧暴露3d后可见肺血管扩张充血，肺泡腔内出现红细胞及炎性细胞，肺间隔断裂，肺泡腔扩大；高氧7天时，炎性渗出、肺水肿、肺出血较前更加明显，部分肺间隔增宽变形，肺组织结构紊乱；14天时更为明显，肺组织结构紊乱，肺间隔重度增厚，出现明显纤维化改变，肺泡发育受阻，肺泡数量明显减少、大小不一，肺泡腔明显增大,部分肺泡融合，可见肺大泡或肺不张。Ⅲ组（干预组）肺组织形态与结构改变较II组有明显减轻。

3．肺组织湿/干重比值（W/D）：实验3天、7天时，Ⅱ组（高氧组）实验动物肺组织湿/干重比值（W/D）较Ⅰ组（空气组）增高（P<0.01），实验14天时，Ⅱ组较Ⅰ组升高更明显（P<0.01），而Ⅲ组（干预组）与Ⅱ组相比，3天、7天、14天的比值均有明显下降（P<0.01）。

4．支气管肺泡灌洗液（BLAF）中蛋白含量（TP）测定：实验3天、7天和14天时Ⅱ组（高氧组）BLAF中TP均高于Ⅰ组（空气组），差异有显著性意义（P<0.01）；Ⅲ组3天时BLAF中TP较II组降低（P<0.05），7天、14天时明显降低（P<0.01）。

5．肺组织中SP-A蛋白表达水平的变化：Westen Blot检查测定结果表明：与I组动物比较，II组（高氧组）实验3天时SP-A蛋白表达明显增高（P<0.01）；7天、14天SP-A蛋白表达下降，14天时下降更明显（P<0.01）。Ⅲ组（干预组）实验3天时SP-A蛋白表达介于I组与II组之间（P<0.05），7天、14天SP-A蛋白的表达均较高氧组组显著升高（P<0.05）。

参考文献

[1]Innate immunity in human newborn infants:prematurity means more than immaturity[J].Tobias Strunk,Andrew Currie,Peter Richmond,Karen Simmer,David Burgner.Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine.2011(1)

[2]Chorioamnionitis-New Ideas from Experimental Models[J].Kramer,Boris W.EN.2011(4)

[3]Survey of Practices Regarding Utilization of Inhaled Steroids in 223 German Neonatal Units[J].Maas,C,Poets,C F,Bassler,D.Neonatology.2010(4)

[4]European Consensus Guidelines on the Management of Neonatal Respiratory Distress Syndrome in Preterm Infants-2010 Update[J].Sweet,David G,Carnielli,Virgilio,Greisen,Gorm,Hallman,Mikko,Ozek,Eren,Plavka,Richard,Saugstad,Ola D,Simeoni,Umberto,Speer,Christian P,Halliday,Henry L.Neonatology.2010(4)

[5]何蓉.高氧肺损伤新生大鼠肺组织中肺表面活性物质相关蛋白-A（SP-A）的mRNA和蛋白表达及布地奈德的干预作用[D].苏州大学,2013.