牛免疫球蛋白A(IGA)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

牛免疫球蛋白A(IGA)ELISA试剂盒用于测定血清，血浆及相关液体样本中牛免疫球蛋白A(IgA)含量。

实验原理

是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被牛免疫球蛋白A(IGA)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的牛免疫球蛋白A(IGA)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品免疫球蛋白A(IGA)的浓度。

牛免疫球蛋白A(IGA)ELISA试剂盒

样本处理要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作步骤：

1.取出试剂盒，室温（20-25℃）放置30分钟。

2.分组：取出96孔板，根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数，把剩余的板条继续冷藏处理。分别设标准品组（6个浓度）、空白孔、待测样品组。注：为减少实验误差，保证准确性，建议设置复孔。

3.加样：依照标准品的顺序分别加入50ul的标准品溶液于空白微孔中；空白对照孔加入50ul的蒸馏水；其余微孔中加入50ul的待测样本。

4.加酶标溶液：标准品组、待测样本组各孔中加入100ul的酶标溶液（空白对照孔除外）。

5.温育：酶标板用封板纸密封后，放入湿盒内于37℃恒温孵育1小时。

6.洗板：用稀释后的洗涤液注满每孔，静置15-30s，充分清洗酶标板5次，用吸水纸彻底拍干。

7.显色：各孔加入显色剂A液50ul后，再加入显色剂B液50ul。

8.终止：25-37℃下避光反应10-15分钟，加入50ul终止液。9.读板：在450nm波长读取各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于PAHs对外周血CYP450、AhR和免疫球蛋白A、G、M的影响研究

探讨长期低剂量PAHs暴露对机体的损伤机制,为筛选可能的生物标志物提供依据。

研究方法选取100名人员，经知情同意后,进行流行病学调查和生物样品的收集并保存备用。采用碱水解-高效液相色谱荧光法测定尿样中1-OHPyr的含量,尿肌酐（Creatinine Cr）进行校正。应用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）测定外周血中CYP450、AhR、IgA、IgG、IgM水平。结合流行病学调查资料,对实验结果进行统计学分析。研究结果此次调查天津市居民尿1-OHPyr含量偏高,原因可能与调查在冬季进行有关。

女性尿1-OHPyr含量高于男性,女性占经常下厨炒菜者的比例为62.5%,占被动吸烟者的比例为64.9%,提示男女生活方式的差异可能是导致尿1-OHPyr含量存在性别差异的主要原因。同时,本次结果显示,PAHs暴露的主要来源为烹调油烟和吸烟。烹调油烟与吸烟存在交互作用,烹调油烟对尿1-OHPyr含量的影响仅在不吸烟者中发现,在吸烟者体内未发现烹调油烟对尿1-OHPyr含量的影响。

普通人群尿1-OHPyr与外周血CYP450存在弱负相关,外周血AhR与CYP450存在正相关（R=0.546,P=0.001）,但尿1-OHPyr与外周血AhR未发现相关性（P>0.05）。随着PAHs内暴露水平的增加,外周血CYP450和AhR含量降低,但都未发现统计学差异（P>0.05）。

尿1-OHPyr在0.025～2.516μmol/mol cr浓度范围内,随着尿1-OHPyr含量的升高,外周血IgA和IgG水平增加；在2.517～4.936μmol/mol cr范围内,外周血IgA、IgG水平反而下降,较0.025～2.516μmol/mol cr浓度范围内有统计学差异（P<0.05）。

外周血IgM水平未发现统计学差异（P>0.05）。提示低剂量PAHs暴露可能使普通人群体液免疫代偿性增强。随着PAHs暴露量增加,外周血IgA、IgG水平降低,免疫功能降低,说明PAHs高暴露可能抑制机体的免疫功能。尿1-OHPyr浓度与外周血IgA浓度呈负相关（R=-0.224,P=0.080）,以外周血IgA为因变量建立的多元线性回归方程中,尿1-OHPyr进入回归模型,外周血CYP450、AhR未进入回归模型,原因可能与CYP450和AhR未参与PAHs的免疫抑制有关。

结论PAHs暴露可以影响外周血CYP450、AhR的含量,并对免疫系统产生影响,其免疫抑制机理可能与CYP450和AhR的调节无关。

参考文献

[1]The effect of aryl hydrocarbon receptor ligands on the expression of polymerase（DNA directed）kappa（Polκ）,polymerase RNA II（DNA directed）polypeptide A（PolR2a）,CYP1B1 and CYP1A1 genes in rat liver[J].Environmental Toxicology and Pharmacology.2012(3)

[2]Biosurveillance humaine,biomarqueurs et biosurveillance environnementale[J].G.Salines.Annales Pharmaceutiques Francaises.2012(4)

[3]DNA adducts in skin biopsies and 1-hydroxypyrene in urine of psoriasis patients and healthy volunteers following treatment with coal tar[J].J.H.J.Roelofzen,P.G.M.van der Valk,R.Godschalk,G.Dettbarn,A.Seidel,L.Golsteijn,R.Anzion,K.K.H.Aben,F.J.van Schooten,L.A.L.M.Kiemeney,P.T.J.Scheepers.Toxicology Letters.2011(1)

[4]Determination of 1-hydroxypyrene in human urine by HPLC with electrochemical detection at a boron-doped diamond film electrode[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry.2012(3)

[5]王芳.PAHs对外周血CYP450、AhR和免疫球蛋白A、G、M的影响[D].天津医科大学,2013.