紫外法蛋白定量试剂盒的应用

背景^[1-3]

紫外法蛋白定量试剂盒利用蛋白的紫外吸收特性检测样本中蛋白的含量。

实验原理：

紫外可见分光光度法是在190～760nm波长范围内测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和定量测定的方法。当光穿过被测物质溶液时，物质对光的吸收程度随光的波长不同而变化。因此，通过测定物质在不同波长处的吸光度，并绘制其吸光度与波长的关系图即得被测物质的吸收光谱。从吸收光谱中，可以确定吸收波长λmax和最小吸收波长λmin。物质的吸收光谱具有与其结构相关的特征性。因此，可以通过特定波长范围内样品的光谱与对照光谱或对照品光谱的比较，或通过确定吸收波长，或通过测量两个特定波长处的吸收比值而鉴别物质。用于定量时，在吸收波长处测量一定浓度样品溶液的吸光度，并与一定浓度的对照溶液的吸光度进行比较或采用吸收系数法求算出样品溶液的浓度。

紫外法蛋白定量试剂盒

蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其吸收峰位于280nm附近（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。在吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯-比耳定律。该测定法具有简单灵敏快速高选择性，且稳定性好，干扰易消除不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定等优点。

蛋白质与生命的起源、存在和进化都密切相关,蛋白质测定涉及到生产和利研的众多领域。本试验用紫外分光光度法进行蛋白质含量的测定,由此分析此方法的特点及适用条件。结果表明,紫外吸收法简单、迅速,且相对较为准确,是测定低浓度蛋白质含量的有效方法。

应用^[4][5]

用于奶及奶制品中乳清蛋白成分的检测技术研究

从如下四个方面对非变性乳清蛋白组分的检测开展研究:1.建立奶及奶制品中非变性β-乳球蛋白的高效液相色谱检测方法试样溶液用冰醋酸调节pH至4.6,离心取上清,上清液中未变性的β-乳球蛋白经高效液相色谱分离,紫外检测器测定,外标法定量。未变性的β-乳球蛋白在生乳和液态奶中的定量限为25.0mg/kg,在奶粉中的定量限为50.0 mg/kg。该方法日间和日内的回收率和精密度实验,分别以超高温灭菌乳和奶粉为样品基质,添加β-乳球蛋白500 mg/kg、1000 mg/kg和2000 mg/kg三个浓度水平,每个浓度水平进行3次重复试验,连续测试3天,结果表明:超高温灭菌乳中β-乳球蛋白的回收率为103.1%～113.6%,RSD为0.4%～1.8%;奶粉中β-乳球蛋白的回收率为101.5%～111.0%,RSD为0.1%～3.2%。检测结果显示,本试验建立的非变性β-乳球蛋白检测方法可以用于不同奶及奶制品的检测。

2. 建立奶及奶制品中非变性乳铁蛋白的高效液相色谱检测方法试样中加入磷酸盐缓冲液提取,离心后取上清液,使用肝素亲和柱富集纯化上清液中的非变性乳铁蛋白,非变性乳铁蛋白经高效液相色谱分离,紫外检测器测定,外标法定量。非变性乳铁蛋白在生乳和液态奶中的定量限为5.0 mg/kg,在奶粉中的定量限为10.0 mg/kg。该方法日间和日内的回收率和精密度实验,以超高温灭菌乳为样品基质,添加乳铁蛋白5 mg/kg、20 mg/kg和50 mg/kg三个浓度水平;以奶粉为样品基质,添加乳铁蛋白10 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg三个浓度水平,每个浓度水平进行3次重复试验,连续测试3天,结果表明:超高温灭菌乳中乳铁蛋白的回收率为92.9%～109.3%,RSD为1.5%～3.2%;奶粉中乳铁蛋白的回收率为97.6%～107.7%,RSD为1.4%～3.1%。检测结果显示,本试验建立的非变性乳铁蛋白检测方法可以用于不同奶及奶制品的检测。

3. 建立奶及奶制品中非变性免疫球蛋白G（IgG）的定量检测方法试样中加入磷酸盐缓冲液提取,离心后取上清液,使用Protein G免疫亲和柱富集纯化上清液中的非变性IgG,非变性IgG经高效液相色谱分离,紫外检测器测定,外标法定量。非变性IgG在生乳、液态奶和奶粉中的定量限为100.0 mg/kg。该方法日间和日内的回收率和精密度实验,分别以超高温灭菌乳和奶粉为样品基质,添加IgG浓度为100 mg/kg、200 mg/kg和400 mg/kg三个浓度水平,每个浓度水平进行3次重复试验,连续测试3天,结果表明:超高温灭菌乳中IgG的回收率为92.0%～103.9%,RSD为1.2%～4.6%;奶粉中IgG的回收率为105.0%～122.5%,RSD为1.2%～4.2%。检测结果显示,本试验建立的非变性乳铁蛋白IgG检测方法可以用于不同奶及奶制品的检测。

4.建立婴儿配方奶粉中乳清蛋白总量的毛细管凝胶电泳检测方法称取135±5 mg脱脂奶粉或500±20 mg婴儿配方奶粉至10 mL刻度离心管中,用去离子水定容到5 mL,涡旋混合均匀。将1%SDS样品溶液与10 kDa IS蛋白质以84:1比例混合,制备分析预备溶液。移取10μL样品溶液至2.0 mL微量离心管中,依次向微量离心管中加入85μL分析预备溶液和5μLβ-巯基乙醇,充分混合,然后在95±5℃的水浴中加热10 min。冷却至室温,然后在室温下以7000 r/min离心1 min,上清液经毛细管凝胶电泳分离,在220 nm紫外波长下检测。脱脂奶粉或婴儿配方奶粉中的酪蛋白和乳清蛋白被分离成两组不互相干扰的蛋白质峰组,根据这两组蛋白质组的峰面积,以及乳清蛋白对酪蛋白的质量对面积校正系数,利用峰面积归一化法,计算出乳清蛋白在婴幼儿配方奶粉总蛋白质中的百分含量。

参考文献

[1]Simultaneous determination of bovineα-lactalbumin andβ-lactoglobulin in infant formulae by ultra-high-performance liquid chromatography–mass spectrometry[J].Yiping Ren,Zheng Han,Xiaojun Chu,Jingshun Zhang,Zengxuan Cai,Yongjiang Wu.Analytica Chimica Acta.2010(1)

[2]Quantitative mass spectrometry in proteomics:a critical review.[J].Bantscheff Marcus,Schirle Markus,Sweetman Gavain,Rick Jens,Kuster Bernhard.Analytical and bioanalytical chemistry.2007(4)

[3]Bovine milk in human nutrition–a review[J].Harstad Odd M,H?stmark Arne T,Haug Anna.Lipids in Health and Disease.2007(1)

[4]Absolute Quantitation ofβ-Lactoglobulin by Protein Liquid Chromatography?Mass Spectrometry and Its Application to Different Milk Products[J].Czerwenka Christoph,Maier Irene,Potocnik Natascha,Pittner Fritz,Lindner Wolfgang.Analytical Chemistry.2007(14)

[5]李鹏.奶及奶制品中乳清蛋白成分的检测技术研究[D].中国农业科学院,2020.