克柔念珠菌的标记及抗克柔念珠菌对策

背景及概述^[1][2]

克柔念珠菌(Candida krusei，同物异名Pichia kudriavzevii、Issatchenkia orientalis)是一种全球范围内临床重要的致病性真菌。克柔念珠菌可引起多种类型的感染，包括皮肤感染、角膜炎、念珠菌血症等。该种病原对临床常用的抗真菌药物——氟康唑 (Fluconazole)具有天然耐药性。

标记^[1]

目前，用于克柔念珠菌主要分子标记仍然是ITS、beta-tublin、Calmodulin等，但这些序列的种内多态性较低，无法满足克柔念珠菌的分子溯源、群体遗传学和分子流行病学研究等工作的需要。

CN201810060340.1提供一种克柔念珠菌STR分子标记，所述STR分子标记为SEQ IDNO:1-40所示序列中的任一个。本发明还提供克柔念珠菌STR分子标记组合，所述STR分子标记组合为权利要求1 所述STR分子标记中的任意两个或多个组合。本发明还提供用于检测上述STR分子标记的引物。本发明还提供用于检测上述STR分子标记的试剂盒。本发明还提供STR分子标记单独或组合使用在克柔念珠菌的分子分型、分子溯源、 群体遗传学和系统进化分析中的应用。

本发明还提供STR分子标记的检测方法，包括以下步骤：

(1)提取克柔念珠菌的基因组DNA；

(2)合成SEQ ID NO:41-120所示的引物，并使用荧光染料对正向引物5'端进行标记，获得荧光标记的引物组；

(3)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用步骤(2)荧光标记的引物组进行PCR 扩增；

(4)对扩增产物中的单色荧光标记DNA片段进行多态性检测。

本发明还提供非诊断目的克柔念珠菌检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样品DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用SEQ ID NO:41-120所示的引物进行PCR扩 增；

(3)分析PCR扩增产物。

本发明的有益效果是：本发明首次提供一套克柔念珠菌的微卫星位点(STR分子标记)组合，其中共包括40个高度多态的微卫星位点(SEQ ID NO:1-40)。同时，提供了一套能 够高效扩增克柔念珠菌群体的特导性引物(SEQ ID NO:41-120)和检测条件。这一套克柔念珠菌的微卫星标记，不仅可以用于球形孢子丝菌的遗传背景分析和分子溯源，同时也可应用于球形孢子丝菌的分子流行病学、群体遗传学和系统进化分析。

抗克柔念珠菌对策^[2]

1 建立标准化抗真菌药物敏感实验

近 20 年来，伴随药敏试验方式的持续完善，抗真菌药物的敏感性结果的真实性更为可信。但也因患者免疫状态的不同，基础疾病的差异，药物间相互影响，抗真菌药物剂量高低区别，疗程长短和血药浓度水平高低的不同，和别种感染因素的影响，如脓肿引流状况，插入导管是否去除等因素造成药敏试验结果与临床治疗情况不符。这就需要我们判断真菌药敏结果要慎重，在将其他会对治疗效果产生不利影响的因素排除后，将最初致感染菌提取出来，同时和治疗失败后分离出的真菌的 MIC进行比较，若其 MIC 显著提升，则显示其耐药性提高。

2新药研发

2.1 嗜铬粒蛋白 A(CGA)-N46

CGA 是分布于内分泌细胞嗜铬颗粒和神经细胞中的一种可溶性蛋白。经过对 CGA 中不同衍生片段的抗菌活性进行检测，结果提示 CGAN 端的CGA-46 显示出极强的抗真菌活性。CGA-N46 能对进行测试的念珠菌属的生长进行抑制，在这之中，克柔念珠菌的敏感性最强。利用暂时对磷脂膜的稳定性进行去除，造成线粒体功能障碍，同时抑制 DNA 合成，CGA-N46 被认为是抗克柔念珠菌感染的最新化合物。

2.2 银纳米颗粒（AgNP）

AgNPs 指利用环保方式，将半胱氨酸视作还原剂合成产生的。在某些学者的认知中，AgNP 可被视为开发新型抗真菌剂的最新化合物，它在成纤维细胞中具有最低的细胞毒性，同时针对具有抗常规真菌化合物抗性的念珠菌属有较强致死性。这就是此类药物的新药研究的潜力体现。

2.3 羧甲基壳聚糖（CM-壳聚糖）

Tan等通过深刻研究，显示 CM-壳聚糖不论是针对单个和混合物中生物膜的非白色念珠菌，均具有显著抑制作用，常见菌属包括了热带假丝酵母，近平滑假丝酵母，还包括了克柔假丝酵母以及光滑念珠菌。所以 CM-壳聚糖不单单可以起到减低念珠菌细胞代谢活性的作用，还可以刺激生物膜的建立和发展，在进行新药物研究中极具价值。

2.4 艾沙康唑

艾沙康唑有可预测的和与剂量成正比的药动学，现已完成Ⅲ期临床试验，一般被用来治疗侵袭性念珠菌病、念珠菌血症，还可被用于治疗侵袭性曲霉病和较为少见的曲霉感染。在艾莎康唑的分子结构式中，其侧链具有很高的真菌 CYP51 蛋白亲和力，造成其抗真菌谱范围更广，甚至将对别种唑类抗真菌药所耐受的真菌也囊括其中。

2.5 阿巴康唑

阿巴康唑是一种生物利用度高、抗真菌活性强的口服制剂，针对足廯已完成Ⅰ期试验评价，用于脚趾甲真菌病治疗已完成Ⅱ期临床试验。

2.6 福司氟康唑

福司氟康唑是氟康唑的磷酸酯前体药物，是以氟康唑为起始原料通过两部合成。福司氟康唑静脉给药 2-3d 即可达到有效血药浓度。安全性好，不良反应小。

3 联合用药

相关动物结果提示，小檗碱及黄芩素能有效提升唑类药物的抗真菌效应。王维欣等研究表明，没食子酸与氟康唑联用对耐药克柔念珠菌的浮游菌表现出体外协同抗真菌作用。有些研究结果显示，枸橼酸托瑞米芬具有明显提升卡泊芬净及两性霉素 B 体内外抗生物被膜活性的作用。

4 老药新剂型

两性霉素 B 脂质体是两性霉素 B 的一种新剂型，发挥其最强杀菌效能的同时降低其毒副作用。20 世纪 90 年代，研发了 3 种不同的两性霉素 B 的脂类复合体，分别是两性霉素 B 脂质体、两性霉素B 脂质复合体和两性霉素 B 胶状分散体。制霉菌素脂质体是游离制霉菌素包裹在多层脂质中，保留其抗菌活性的同时降低其肾毒性。灰黄霉素的卵磷脂脂质体也于 20 世纪 90 年代研发，其肝毒性大大低于常规灰黄霉素口服剂。

5 抗真菌中草药

中草药因其所具备的来源多、抗菌谱广、毒性小、耐药性产生率低等优势引起了多方关注。有研究提示，大蒜、地锦草、黄芩、鱼腥草等都具备较高的抗真菌性。还有研究对这一轮点进行了进一步肯定，研究显示大蒜素可有效抑制生物膜的黏附和胞外多糖的产生；苦参碱则能够显著阻碍白念珠菌的黏附和菌丝生长；黄芪苷可抑制真菌DNA 的合成而达到抗菌作用。

主要参考资料

[1] CN201810060340.1 克柔念珠菌STR分子标记及其应用

[2]刘然.克柔念珠菌的耐药机制及抗真菌对策研究进展[J].智慧健康,2018,4(22):61-64.