THP-1人急性单核细胞白血病细胞的应用

背景^[1-3]

THP-1人急性单核细胞白血病细胞是从一名患有急性单核细胞白血病的1岁小男孩的外周血中分离得到的，自1980年建系以来，THP-1细胞被广泛用于单核细胞和巨噬细胞相关的机制、信号通路以及营养和药物运输等研究中。相对于U937、HL-60、ML-2等白血病细胞系，THP-1更有类似人原代单核细胞的形态和功能特征（包括细胞分化标记）。相对于人外周血单核细胞（PBMC），THP-1更易在实验室中培养和扩增，且具有更稳定的基因背景，不存在PBMC的个体差异性问题，利于实验结果的重现。

THP-1人急性单核细胞白血病细胞

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基；北美胎牛血清，10%；双抗1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于NaF诱导急性单核细胞白血病THP-1细胞凋亡及机制初步探讨研究

通过观察NaF对THP-1细胞α-醋酸萘酚酯酶（a-NAE）活性的特异性抑制作用及其对THP-1细胞的增殖抑制和凋亡作用以及对凋亡相关基因Bcl-2和Bax表达的影响,初步探讨以此为基点的NaF诱导THP-1细胞凋亡的可能机制,为急性单核细胞白血病的靶向治疗提供新的思路。

方法：（1）以人急性单核细胞白血病细胞株THP-1细胞作为研究对象进行细胞培养,用不同浓度NaF（0、0.5、1、2、4、8mM）处理,其中OmM作为对照组；

（2）瑞氏染色观察NaF处理前后THP-1细胞形态变化；

（3）α-NAE染色定性观察NaF对THP-1细胞α-NAE活性的影响,显色法定量检测THP-1细胞中α-NAE活性变化；

（4）改良MTT法检测NaF对THP-1细胞的增殖抑制作用；

（5）流式细胞术Annexin V/PI检测NaF对THP-1细胞的凋亡作用；

（6）RT-PCR检测NaF对THP-1细胞Bcl-2mRNA和BaxmRNA表达的影响。

结果：（1）细胞形态学变化：倒置显微镜观察细胞培养结果,对照组细胞呈悬浮生长,圆形,大小均匀,折光性好,透明,背景清亮；NaF作用24h后,细胞皱缩,大小不一,胞膜破损,轮廓模糊,甚至裂解消失,背景变混浊。瑞氏染色观察形态,NaF作用24h后细胞出现了凋亡形态变化,细胞大小不一,胞膜碎裂,边缘不整,胞质浓缩,核固缩,核染色质凝集,出现凋亡小体。

（2） α-NAE活性变化：NaF作用24h后,涂片做α-NAE染色定性观察,可见随着药物浓度增加THP-1细胞α-NAE反应阳性强度及阳性率逐渐降低；显色法定量检测结果显示,THP-1细胞中α-NAE活性随NaF浓度增加而降低（P<0.05）。

（3） MTT结果：NaF在低浓度（0.5-1mM）时对THP-1细胞的增殖无明显抑制作用（P>0.05）；在高浓度（2-8mM）时抑制THP-1细胞增殖,且呈现出时间-剂量效应关系（P<0.05）。24h、48h、72h的半数抑制浓度（IC50）分别为：4mM、2.75mM、2.4mM。

（4） Annexin V/PI凋亡检测结果：NaF可诱导THP-1细胞凋亡,药物作用24h后,细胞凋亡率随药物浓度增高而增加,与对照组比较除0.5mM、1mM浓度组外差异均有统计学意义（P<0.05）。

（5） RT-PCR结果：NaF作用24h后,在2-8mM浓度范围内,Bcl-2mRNA表达水平随药物浓度增加下降（P<0.05）,BaxmRNA表达水平随药物浓度增加而增高（P<0.05）。

结论：（1）NaF在2-8mmol/L浓度范围内能剂量依赖性的抑制THP-1细胞增殖并诱导其凋亡,其机制之一可能是通的上调BaxmRNA表达和下调Bcl-2mRNA表达途径实现。

（2）NaF诱导THP-1细胞凋亡的过程中伴随着α-醋酸萘酚酯酶活性的下降,提示NaF特异性抑制单核细胞α-醋酸萘酚酯酶可能在其诱导的THP-1细胞凋亡中起了一定的作用；为急性单核细胞白血病的靶向治疗提供了新思路。

参考文献

[1]Arsenic and fluoride induce neural progenitor cell apoptosis[J].Toxicology Letters.2011(3)

[2]Molecular mechanisms of fluoride toxicity[J].Olivier Barbier,Laura Arreola-Mendoza,Luz María Del Razo.Chemico-Biological Interactions.2010(2)

[3]Characteristics of NaF‐induced differentiation of HL‐60 cells[J].TomoyukiKawase,AkiraOguro,MichiakiOrikasa,Douglas M.Burns.J Bone Miner Res.2009(11)

[4]Pattern of expression of apoptosis and inflammatory genes in humans exposed to arsenic and/or fluoride[J].Science of the Total Environment.2009(4)

[5]方鹏.NaF诱导急性单核细胞白血病THP-1细胞凋亡及机制初步探讨[D].中南大学,2013.