人表皮细胞生长因子受体(EGFR)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人表皮细胞生长因子受体(EGFR)ELISA试剂盒采用夹心法酶联免疫吸附法，用于体外定量分析人血清、血浆、母乳、细胞裂解液或细胞培养上清中EGFR的含量。

检测原理：

预先包被的抗体和检测相抗体都是EGFR多克隆抗体，检测相抗体经生物素标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人EGFR呈正相关。

人表皮细胞生长因子受体(EGFR)ELISA试剂盒

表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)，属于受体酪氨酸激酶家族(EGFR,ErbB2,ErbB3,ErbB4)。EGFR对EGF和TGFα都有亲和力。人的EGFR基因表达1210个氨基酸残基，其中24个引导肽，621个细胞外部分，23个为跨膜部分，542个是细胞内功能区。本试剂盒所用的标准品为重组人的EGFR细胞外功能区（1-645），糖化后分子量100～115KDa。

样品准备：

细胞培养上清、母乳：离心去除沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

血清：用干净试管收集血液，室温凝固30分钟，离心2000×g 20分钟，收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

血浆：采用肝素或EDTA抗凝，抽血后30分钟内在2～8℃离心2000×g 20分钟。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常10秒后，细胞就会被裂解。

实验步骤：

使用前应将试剂盒的所有组分和待检样本温度恢复到室温。强烈建议所有的标准品和待检样本进行双复孔测定。

1．按前述试剂准备项准备好各种试剂、标准品和待测样本。

2．计算检测样本所需酶标条，将酶标条从铝箔袋取出，剩余的酶标条放回铝箔袋中并封好袋口，低温保存。

3．洗板：用1×洗涤缓冲液(300μL/孔)洗板三次，拍干酶标板。洗板对试验结果有重要影响，确保最后一次拍板没有洗液残留。

4．样本孵育：加入标准品和待测样本，100μL/孔，确保15分钟内完成点样，室温孵育2小时。

5．洗板：弃去孔中液体，加入1×洗涤缓冲液(300μL/孔)洗板三次，拍干酶标板。

6．酶标检测抗体孵育：将预先配制至工作浓度的检测抗体加入酶标板中，100μL/孔，混匀，室温孵育1小时。

7．洗板：弃去孔中液体，加入1×洗涤缓冲液(300μL/孔)洗板三次，拍干酶标板。

8．显色：将预先配制的底物液加入酶标板中，200μL/孔，混匀，室温避光孵育20分钟。

9．终止：加入50μL/孔终止液至酶标板中，轻轻震动酶标板至显色均匀。

10．读值：20分钟内读取450nm的光吸收值。

应用^[4][5]

用于利用人工油体和植物油体表达人表皮细胞生长因子hEGF的研究

以hEGF为目的蛋白,研究利用人工油体表达系统和植物油体表达系统,表达和生产目的蛋白的可行性,主要内容和结果包括:（1）按照植物偏爱密码子人工合成了hEGF的编码基因;

（2）构建了3个hEGF的E.coli表达载体:hEGF/pET32a、OLEOSIN-hEGF/pET28a、OLEOSIN-hEGF/pET32a;构建了1个植物油体表达载体pESCV2301;

（3）SDS-PAGE和Western分析发现:a.hEGF/pET32a[Rosetta-gamiTM2（DE3）pLysS]IPTG诱导后,可检测到目的蛋白的表达,表达的hEGF蛋白主要以可溶形式存在;b.OLEOSIN-hEGF/pET28a[Rosetta 2（DE3）]IPTG诱导后,未检测到目的蛋白的表达;c.OLEOSIN-hEGF/pET32a[Rosetta-gamiTM2（DE3）pLysS]IPTG诱导后,可检测到OLEOSIN-hEGF融合蛋白的表达,表达的蛋白主要以包涵体形式存在。

（4）利用AKATA亲和层析,分离获得hEGF蛋白,蛋白纯度大于80%,MTT法“细胞增殖实验”结果表明表达的hEGF蛋白可显著促进细胞增殖,具有生物学活性,活性与Sigma公司销售的hEGF基本相同;

（5）人工油体体外重组实验结果表明E.coli中表达OLEOSIN-hEGF融合蛋白可在pH7.5的磷酸钠缓冲液中与橄榄油、磷脂酰胆碱重组形成油体,显微镜检发现,重组油体与油菜中提取获得的油体在结构,稳定性上无显著差别;

（6）用农杆菌介导法,将OLEOSIN-hEGF融合蛋白基因转入油菜中双4号,获得转基因油菜3株,转基因油菜的分子检测正在进行,收获种子后可对转基因油菜中和E.coli中表达的OLEOSIN?hEGF进行各项比较。

参考文献

[1]Milk Epidermal Growth Factor and Gut Protection[J].Bohuslav Dvorak.The Journal of Pediatrics.2010(2)

[2]A rapid and non‐destructive screenable marker,FAST,for identifying transformed seeds of Arabidopsis thaliana[J].Takashi L.Shimada,TomooShimada.The Plant Journal.2010(3)

[3]The C-terminal cytoplasmic domain of human proEGF is a negative modulator of body and organ weights in transgenic mice[J].Thomas Klonisch,Aleksandra Glogowska,Ana A.Gratao,Marjeta Grzech,Andreea Nistor,Mark Torchia,Ekkehard Weber,Martin Hrabéde Angelis,Birgit Rathkolb,Cuong Hoang-Vu,Eckhard Wolf,Marlon R.Schneider.FEBS Letters.2009(8)

[4]Development and characterization of monoclonal antibodies against human epidermal growth factor receptor in Balb/c mice[J].Behzad Baradaran,Ahmad Zavaran Hosseini,Jafar Majidi,Safar Farajnia,Jaleh Barar,Zohair Hassan Saraf,Jalal Abdolalizadeh,Yadollah Omidi.Human Antibodies.2009(1,2)

[5]赵宏.利用人工油体和植物油体表达人表皮细胞生长因子hEGF[D].中国农业科学院,2010.