小鼠2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

小鼠2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)ELISA试剂盒用于测定血清、血浆及相关液体样本中2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)的含量。

实验原理：

小鼠2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被小鼠2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的小鼠2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

小鼠2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)ELISA试剂盒

标本要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

操作流程

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于利用重组大肠杆菌生产2，3-二磷酸甘油酸的研究

2,3-二磷酸甘油酸（2,3-BPG,2,3-Bisphosphoglycerate）是生命体内糖酵解途径的中间产物1,3-二磷酸甘油酸（1,3-BPG,1,3-Bisphosphoglycerate）的同分异构体,由仅存在于血红细胞和胎盘中的酶——二磷酸甘油酸变位酶（BPGM,Bisphosphoglycerate mutase,旧称DPGM,diphosphoglycerate mutase）催化1,3-BPG生成。最早于1925年被发现的2,3-BPG直到上世纪60年代其功能才由Benesch等人阐明。

因为2,3-BPG是血红蛋白的别构调节物,与血红蛋白等摩尔结合,因此是调节O2和血红蛋白亲和力的重要因素。当血液流经组织时,高含量的2,3-BPG的存在能显著增加O2的释放并供组织需要。因此,2,3-BPG在预防和治疗高原反应,提高运动员身体机能等方面有着极大的应用价值。

鉴于目前尚无人工合成2,3-BPG的报道,也无合适方法从血液中富集回收,考虑运用基因工程的方法来进行2,3-BPG的生产。因为大肠杆菌中不存在BPGM,也不存在2,3-BPG。因此将表达BPGM的质粒pET30c-BPGM转入大肠杆菌并以IPTG进行诱导,通过向培养基中加入葡萄糖,利用大肠杆菌的糖酵解途径来生产2,3-BPG。

资料显示BPGM在Cl-的存在下主要发挥磷酸酶活性将2,3-BPG分解为3-PGA和无机磷,通过孔雀石绿法定磷法检测无机磷在630nm的吸光度,根据无机磷标准曲线得到发酵产品中2,3-BPG的含量。在培养条件上,我们摸索到合适的葡萄糖浓度为10g/L,合适的诱导时间为4 h,并发现在诱导时加入终浓度0.5%的Tween 80可以促进2,3-BPG穿过大肠杆菌细胞壁分泌入培养基。为接下来的回收纯化工作打下了良好的基础。

参考文献

[1]Metabolic pathway analysis of enzyme-deficient human red blood cells[J].BioSystems.2004(1)

[2]Bisphosphoglycerate mutase and pyruvate kinase activities during maturation of reticulocytes and ageing of erythrocytes[J].J.Luque,M.D.Delgado,P.Rodriguez-Horche,M.T.Company,M.Pinilla.Bioscience Reports.1987(2)

[3]Toxoplasma gondii:Bradyzoite Differentiation In Vitro and In Vivo.[J].Mayoral Joshua,Di Cristina Manlio,Carruthers Vern B,Weiss Louis M.Methods in molecular biology（Clifton,N.J.）.2020

[4]G2-quadruplex in the 3’UTR of IE180 regulates Pseudorabies virus replication by enhancing gene expression.[J].Zhang Yashu,Liu Sisi,Jiang Hui,Deng Hui,Dong Chen,Shen Wei,Chen Haifeng,Gao Chao,Xiao Shaobo,Liu Zheng-Fei,Wei Dengguo.RNA biology.2020(6)

[5]黄晚.利用重组大肠杆菌生产2，3-二磷酸甘油酸的研究[D].复旦大学,2010.