人过氧化氢酶(CAT)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人过氧化氢酶(CAT)ELISA KIT运用双抗体夹心ELISA酶联免疫法定量测定血清、血浆或其它相关生物液体样本中过氧化氢酶(CAT)的含量。

检测原理

试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人过氧化氢酶（CAT）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的人过氧化氢酶（CAT）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人过氧化氢酶(CAT)ELISA KIT

样品收集、处理及保存方法

1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

检测程序

1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。

2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

3.每孔中加入抗体工作液10 0ul。将反应板充分混匀后置37℃6 0分钟。

4.洗板：同前。

5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃3 0分钟。

6.洗板：同前。

7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。

8.每孔加入100ul终止液混匀。

9.30分钟内用酶标仪在45 0 nm处测吸光值。

结果计算与判断

1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。

2.以标准品20 00、100 0、500、250、125、62.5、31.2、0 pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应CAT含量，再乘上稀释倍数即可。

应用^[4][5]

用于人过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达研究

生物体在新陈代谢中,细胞有氧呼吸所消耗的O2约10%被还原成H2O2。后者很容易被细胞中各种还原剂还原成·OH和OH-,而·OH是极毒的羟自由基,能氧化与它接触的几乎所有细胞组份,引起衰老、癌变及其它病症。生物体内存在的过氧化氢酶（catalase,CAT）能有效地催化细胞中产生的高浓度H2O2（2H2O2→O2+2H2O）,从而防止自由基对细胞的损伤。此外,CAT具有重要的工业应用价值。目前商品化的过氧化氢酶主要来源于牛肝、微球菌和黑曲霉,主要用于工业生产。对于医药和保健来说,人源的CAT应用价值更高。

利用基因重组技术实现人CAT基因在大肠杆菌中实现了有生物活性的表达,为其开发利用奠定了基础。本实验使用人cDNA文库,利用嵌套式PCR技术,获得了编码人CAT基因完整读码框的cDNA序列,选用pMAL-c2x、pBV221质粒作为载体,经过定向克隆将人CAT基因分别构建了融合pMAL-c2x-CAT和非融合表达载体pBV-CAT,并转化到大肠杆菌TB1和JM109中实现表达。

在融合表达中,分别选择了37℃、28℃、20℃作为不同诱导温度对pMAL-c2x-CAT重组菌进行诱导表达。随着温度的降低,可溶性目的蛋白的表达量逐步增加,12h诱导后表达产物可占总菌蛋白的23%。该表达产物（MBP-CAT）经亲和层析纯化后并未表现出CAT活性。

用Factor Xa将MBP蛋白切掉后,产物明显具有CAT活性,说明MBP蛋白的存在可能影响了CAT蛋白的正确折叠,从而影响了它的酶学活性。而在pBV221-CAT非融合表达体系中,经温度诱导后,目的蛋白不仅呈可溶性,且具有CAT活性,但表达量较低。

在目的蛋白的活性测定中,采用了KMnO4染色法和紫外分光光度法进行活性测定。KMnO4染色法方法简便直观,易操作,特异性好,但不适用于活性定量测定；而紫外分光光度法检测速率快,灵敏度高,操作简便,适于过氧化氢酶活性的快速定量测定。还对重组酶的性质进行了研究（酶的热稳定性、pH稳定性）,为以后重组人过氧化氢酶的进一步开发利用及生产、医药等方面的应用奠定了基础。

参考文献

[1]Anti-angiogenic,Antioxidant,and Anti-carcinogenic Properties of a Novel Anthocyanin-Rich Berry Extract Formula[J].D.Bagchi,C.K.Sen,M.Bagchi,M.Atalay.Biochemistry（Moscow）.2004(1)

[2]Immune cells:free radicals and antioxidants in sepsis[J].Victor M.Victor,Milagros Rocha,Monica De la Fuente.International Immunopharmacology.2004(3)

[3]Oxidant signals and oxidative stress[J].Toren Finkel.Current Opinion in Cell Biology.2003(2)

[4]Decreased oxidative stress in patients with ulcerative colitis supplemented with fish oilω-3 fatty acids[J].Décio Sabbatini Barbosa,Rubens Cecchini,Mirian Zebian El Kadri,Maria Aparecida Marchesan Rodríguez,Roberto Carlos Burini,Isaias Dichi.Nutrition.2003(10)

[5]耿风廷.人过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达[D].河北大学,2007.