人生长激素(GH)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人生长激素(GH)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人生长激素（GH）的含量。

实验原理:

本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗人GH单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的GH与单抗结合，加入生物素化的抗人GH，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，GH浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中GH浓度。

人生长激素(GH)ELISA试剂盒

[操作步骤]

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

[实验结果计算]

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

用于人生长激素在毕赤酵母中的分泌表达研究

重组人生长激素（rhGH）是人类生长发育所必须的,对人体的生长发育非常重要,所以在临床上的需求量很大。因此,有必要开发出一种高效的发酵工艺来生产出高纯度的rhGH。

为了能够实现在毕赤酵母中高表达rhGH的要求,根据人生长激素的氨基酸序列和酵母菌密码子的偏好性,对人生长激素基因的密码子进行全局优化,屏蔽所有的稀有密码子,在其上游添加了启动子和信号肽序列,拟合成序列全长1040 bp,共设计并利用化学方法合成了30条单链寡核苷酸。

通过改进的两步法进行生物拼接成全基因,再克隆到pUC18载体中,经过篮白筛选,挑取阳性克隆测序,得到2个全正确的克隆。通过聚合酶链式反应技术来扩增得到了生长激素基因,然后将扩增得到的生长激素基因插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,该载体拥有AOX1启动子和α分泌信号肽序列,构建出pPIC9K/hGH重组酵母表达载体,然后再利用电击转化毕赤酵母GS115,利用G418筛选菌株,得到整合多拷贝人生长激素基因,该基因株通过进一步的摇瓶培养生长,再通过甲醇的诱导,成功实现了生长激素在毕赤酵母中的分泌表达。

然后使用SDS-PAGE技术进行活性分析。经聚合酶链式反应技术扩增酵母基因组DNA的结果显示,目的基因已被成功的整合到了毕赤酵母的染色体当中。筛选出的菌株用甲醇来诱导表达重组目的蛋白,使用SDS-PAGE和Western Blotting技术对表达的产物进行鉴定,在22kD附近存在一条很明显的带,并且颜色随诱导时间的增加而越来越深。而对照组没有出现条带,Western blotting鉴定的结果表明该重组蛋白为重组人生长激素。利用Folin-酚法测定标准浓度的酪蛋白,测得上清中的总蛋白含量是1.21mg/ml。

用ELISA法测定样品的hGH的OD490值为0.217,通过标准曲线的公式计算得出,上清中的hGH的含量是330μg/ml。由此计算得出hGH占上清总蛋白的27.2%。将3K超滤后的样品进行步层析时,选用Q-sepharose FF为层析介质,10mM PB,pH7.5为上样缓冲液,采用10%Solution B阶段洗脱目的蛋白;在第二步层析时,选用phenyl-sepharose FF为层析介质,10mM PB+1M（NH4）2SO4,pH7.5为上样缓冲液,并用10mM PB,pH7.5作为洗脱缓冲液,经过两步层析后rhGH的纯度达到98%以上。

经过基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI TOF MS）测定,重组hGH的相对分子质量为22 113 Da,N-端氨基酸测序显示rhGH的N-端的7个氨基酸为PTIPLSR。重组hGH的生物学活性利用去脑垂体大鼠体重法测定,实验可靠性测验符合标准,同批rhGH样品的PT为4.29 IU/1.33 mg,代表试验误差的可信限率（FL）26.6%,比活为3.2 IU/mg。此外还优化了rhGH的发酵工艺,能够使rhGH蛋白质的表达水平得到很大的提高。

参考文献

[1]Expression and purification of non-tagged recombinant mouse SPP1 in E.coli and its biological significance[J].Shunyan Weng,Liang Zhou,Lei Han,Yunsheng Yuan.Bioengineered.2014(6)

[2]Effects of growth hormone and insulin‐like growth factor I on T‐and B‐lymphocytes and immune function[J].M.Geffner.Acta Paediatrica.2012(S423)

[3]Enhancement of cell viability and alkaline polygalacturonate lyase production by sorbitol co-feeding with methanol in Pichia pastoris fermentation[J].Zhihao Wang,Yun Wang,Dongxu Zhang,Jianghua Li,Zhaozhe Hua,Guocheng Du,Jian Chen.Bioresource Technology.2009(4)

[4]Novel Secretion System of Recombinant Saccharomyces cerevisiae Using an N‐terminus Residue of Human IL‐1βas Secretion Enhancer[J].JeewonLee,Seong‐IIChoi,Jun SungJang,KiryongJang,Jae WoongMoon,Cheon SoonBae,Doo SukYang,Baik LinSeong.Biotechnol Progress.2008(5)

[5]郭丹.人生长激素在毕赤酵母中的分泌表达[D].吉林大学,2020.