CALU-3 人肺腺癌细胞的应用

背景^[1-3]

CALU-3人肺腺癌细胞是从一名25岁的白人男性肺腺癌患者的胸水中分离建系的；该患者曾使用过进行治疗。Calu-3细胞接种至裸鼠可成瘤；Calu-3细胞亦可作转染宿主。

CALU-3人肺腺癌细胞

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备培养基；北美胎牛血清，10%；双抗1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二．细胞处理：

复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

1.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

2.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

3.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

应用^[4][5]

用于细胞膜仿生壳聚糖基纳米载体用于蛋白药物的肺给药治疗研究

以msFGFR2c作为包载的目的蛋白,通过离子交联法制备了载药纳米微粒PCCs/msFGFR2c,并以水溶性季铵盐壳聚糖HTCC构建HTCC/msFGFR2c为对照,测得PCCs/msFGFR2c和HTCC/msFGFR2c的粒径分别在190nm和210nm左右,相应表面电位分别在0.81mV和9.7mV左右。PCCs/msFGFR2c、HTCC/msFGFR2c的包封率分别在47.2%和27.19%左右,载药量分别在9.4%和5.8%左右。原子力显微镜和透射电镜显示纳米粒子形态为类球型。

体外释药试验得出:在24h内,PCCs/msFGFR2c在pH=5.5和7.4的体外环境下释放率分别达到了84%和76%,HTCC/msFGFR2c则分别为76%和70%,表明PCCs纳米系统具有较好的药物缓释功能。体外细胞毒性实验结果表明:当PCCs纳米粒（PCCs-NP）的浓度达到2.0mg/mL时,对MRC-5和Calu-3细胞均无毒性,而HTCC纳米粒（HTCC-NP）的浓度达到0.5mg/mL时就已经对MRC-5和Calu-3细胞有毒性,说明PCCs-NP的生物相容性优于HTCC-NP。

细胞摄取实验结果表明:MRC-5和Calu-3细胞摄取PCCs和HTCC及其纳米载体粒子存在时间和浓度依赖性,在一定摄取时间和摄取浓度范围内呈正相关。荧光纳米载体微粒在亚细胞水平的分布实验得到:在2.0h内被摄入的纳米载体粒子主要分布在细胞Calu-3的细胞质中,在细胞溶酶体内没有观察到纳米载体粒子。以Calu-3细胞建立Transwell呼吸道上皮细胞转运模型。

TEER实验结果显示:在AP端加入浓度为0.125mg/mL的荧光标记PCCs-NP和HTCC-NP纳米载体粒子作用4h,经过24h后TEER值均能够完全恢复,表明两者在该浓度作用4h内对Calu-3细胞单层紧密连接结构的影响是可逆的;但是在AP端加入浓度为0.25mg/mL的荧光标记纳米粒子时,PCCs-NP对Calu-3单细胞层TEER的影响是可恢复,而HTCC-NP对Calu-3细胞单层TEER的影响不可恢复,表明此浓度作用下PCCs-NP对Calu-3细胞单层紧密连接结构的影响是可逆的,而HTCC-NP对Calu-3细胞单层紧密连接结构的影响则不可逆。转运试验结果表明:壳聚糖衍生物PCCs和HTCC制成纳米粒子PCCs-NP、HTCC-NP后,其跨Calu-3细胞单层的转运效率和表观渗透系数Papp都有所提高。

免疫荧光实验表明:在作用浓度为0.25mg/mL时,PCCs-NP对紧密连接蛋白ZO-1的表达几乎没有影响,PCCs和HTCC都能在不同程度上减弱ZO-1的表达,HTCC-NP则能够完全抑制ZO-1的表达,表明两种纳米载体具有不同的跨上皮细胞层机制。建立博来霉素诱导的Wistar大鼠肺纤维化模型,通过肺给药方式研究了负载msFGFR2c的纳米系统对肺纤维化大鼠的疗效。

大鼠的体重、肺组织HE及Massion染色、X光结果都表明PCCs/msFGFR2c纳米系统对肺纤维化有明显的抑制作用,且优于自由msFGFR2c组。总的来说,本研究制备的仿生纳米载体粒子具有良好的生物相容性,可以改善蛋白药物的经肺给药治疗效果,有望成为一种优良的肺给药蛋白药物载体材料。

参考文献

[1]Self assembling nanocomposites for protein delivery:Supramolecular interactions of soluble polymers with protein drugs[J].Stefano Salmaso,Paolo Caliceti.International Journal of Pharmaceutics.2013(1)

[2]Airway delivery of peptides and proteins using nanoparticles[J].Christophe Y.Dombu,Didier Betbeder.Biomaterials.2013(2)

[3]Chitosan-based drug nanocarriers:Where do we stand?[J].Marcos Garcia-Fuentes,Maria J.Alonso.Journal of Controlled Release.2012(2)

[4]Polyamidoamine dendrimers surface-engineered with biomimetic phosphorylcholine as potential drug delivery carriers[J].Lan Jia,Jian-Ping Xu,Hai Wang,Jian Ji.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces.2011(1)

[5]房邦仁.细胞膜仿生壳聚糖基纳米载体用于蛋白药物的肺给药治疗[D].暨南大学,2018.