大鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA试剂盒用检测血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清液等相关样本中超氧化物歧化酶(SOD)的活性或浓度。

实验原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大鼠超氧化物歧化酶（SOD）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠超氧化物歧化酶（SOD）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

样本处理及要求：

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA、者柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

大鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA试剂盒

操作步骤:

实验开始前，各试剂均应平衡至室温；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品稀释液100μL，余孔分别加样品稀释液50ul和样品50μL，注意不要有气泡，轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜，37℃孵育30分钟。

2.洗板3次，弃去液体，甩干或吸干。每个孔中加入配制好的酶标抗体工作液100μL（在使用前30分钟内配制），酶标板加上覆膜，37℃温育30分钟。

3.弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，大约350μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。

4.提前将TMB A组分和B组分37℃温育15分钟

5.按用量1：1混合TMB A组分和B形成TMB工作液（用干净的枪头分别吸取B组分和A组分），每孔加(TMB工作液)90μL，酶标板加上覆膜37℃避光孵育7-10分钟（根据实际显色，情况酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止）。

7.每孔加终止液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。

8.立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（OD值）。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。

9.实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存。

应用^[4][5]

用于RIRI大鼠脑内细胞外超氧化物歧化酶的表达变化研究

观察大鼠RIRI模型脑内的丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量、H2O2含量、抗氧化酶EC-SODm RNA表达水平、EC-SOD蛋白表达水平、以及MDA含量、H2O2含量与EC-SOD表达水平的相关性,探讨RIRI对脑内氧化应激的影响,以及在此过程中EC-SOD可能起到的抗氧化作用。

方法:1大鼠肾缺血再灌注损伤模型制备、分组及取材12只体重200±10 g的雄性Wistar大鼠随机分为对照组（Con）和肾缺血再灌注损伤组（RIRI）,各组6只。RIRI大鼠模型的制备:首先6%水合氯醛按5ml/kg标准进行腹腔注射,用以大鼠麻醉。然后将RIRI组大鼠切开腹壁暴露两侧肾脏,切除其右肾,然后钝性分离左侧肾动脉,于肾门处用无创伤动脉夹夹闭左肾动脉,随后即可观察到肾的颜色由鲜红逐渐变暗失去光泽转为暗红色。夹闭45分钟移除动脉夹,恢复左侧肾脏血液供应,肉眼可见左侧肾动脉再次充盈,颜色由暗红色迅速恢复为鲜红色,表明左肾血液再灌注成功。Con组大鼠切开腹壁后切除右侧肾脏,于左侧肾门处分离左肾动脉,但是并不夹闭。血液再灌注24小时后,再次麻醉大鼠,在大鼠右颈总动脉收插管收集大鼠血液5ml,血液3000rpm离心10min,收集血清用来检测肌酐（Serum Creatinine,SCr）和尿素氮（Blood Urea Nitrogen,BUN）的浓度;取大鼠左肾和脑,将左侧肾脏置于4%多聚甲醛溶液中进行固定,采用HE染色法观察左侧肾脏的形态结构。脑组织置于液氮中-80度冰箱保存,用于MDA含量、H2O2含量、抗氧化酶EC-SOD m RNA表达水平、EC-SOD蛋白表达水平的测定。

2观测指标及其方法2.1血清中SCr和BUN水平的检测血清中SCr的含量用苦味酸法检测;血清中BUN的含量用酶偶联速率法检测。

2.2采用HE染色法观察大鼠左肾的形态结构左侧肾脏经乙醇脱水、二甲苯透明,石蜡包埋后,用莱卡切片机切片厚约5μm,采用苏木精伊红染色树胶封片后,在奥林巴斯光学显微镜下观察左侧肾脏的形态结构。

2.3制备大鼠脑组织匀浆液以及测定其MDA的含量将脑组织从-80℃冰箱中取出,按照10mg/100μl标准加入4度匀浆缓冲液。匀浆缓冲液包含:磷酸钾缓冲液50mmol/L,盐酸苯甲脒1mmol/L,PH7.4,PMSF1mmol/L,Na Cl0.5mol/L,0.1%Tween-20,EDTANa3 1mmol/L,5mmol/Lβ-巯基乙醇。在冰浴下脑组织匀浆2分钟,4000rpm 4℃离心匀浆液20min,取上清即为10%脑组织匀浆液。脑组织匀浆液中MDA的含量用南京建成丙二醛（MDA）含量测定试剂盒检测。

结论:1 RIRI可使其脑组织处于高度的氧化应激状态,脑组织遭受过氧化损伤。

2肾缺血再灌注损伤发生后,抗氧化酶EC-SOD基因和蛋白表达水平明显增强,并与脑组织MDA含量、H2O2含量均呈正相关。表明EC-SOD在此过程中可能发挥了抗氧化应激作用。

参考文献

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[4]Translational value of animal models of kidney failure[J].Alberto Ortiz,Maria D.Sanchez-Ni?o,Maria C.Izquierdo,Catalina Martin-Cleary,Laura Garcia-Bermejo,Juan A.Moreno,Marta Ruiz-Ortega,Juliana Draibe,Josep M.Cruzado,Miguel A.Garcia-Gonzalez,Jose M.Lopez-Novoa,Maria J.Soler,Ana B.Sanz.European Journal of Pharmacology.2015

[5]郝斌.RIRI大鼠脑内细胞外超氧化物歧化酶的表达变化[D].河北医科大学,2016.