ECV-304细胞专用培养基的应用

背景^[1-3]

ECV-304细胞专用培养基保持ECV-304细胞的生长状态。本产品中已包含ECV-304细胞生长所需的各种成分，无需添加任何成分，可直接用于ECV-304细胞的体外培养。

ECV-304细胞专用培养基

细胞培养操作规程

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备M199培养基；优质胎牛血清，15%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3ml此细胞的培养基终止消化。

3.轻轻吹打后吸出，移入15ml离心管中，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养液后吹匀。

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

应用^[4][5]

用于二氢睾酮对过氧化氢诱导的ECV-304细胞凋亡的保护作用研究

究二氢睾酮（dihydrotestosterone,DHT）对过氧化氢诱导的ECV-304细胞凋亡的保护作用及可能机制,分析雄激素对血管内皮细胞及动脉粥样硬化的作用。

方法：采用合适浓度过氧化氢（H2O2 100μM）诱导损伤ECV-304细胞,造成细胞凋亡模型;利用不同浓度二氢睾酮（0.01,0.1,1μM）预处理细胞;根据不同处理方法将实验细胞分为6组:正常对照组,单纯H2O2损伤组,低浓度DHT处理组（0.01μM）,中浓度DHT处理组（0.1μM）,高浓度DHT处理组（1μM）,高浓度DHT对照组（1μM）。通过光镜观察细胞形态、MTT法检测细胞活性和流式细胞仪检测凋亡细胞比例,观察二氢睾酮对过氧化氢诱导的细胞凋亡的保护作用;通过WesternBlot法检测Caspase-3、Caspase-9和phospho-p38 MAPK表达,观察此种保护作用的可能机制。

结果：1光镜细胞形态学观察①在正常对照组和高浓度DHT对照组（1μM）可见极少量凋亡细胞。②单纯H2O2损伤组,大部分细胞显示出凋亡的征象,比如染色质分离、染色体浓缩、胞体皱缩等。③在另外三组不同浓度DHT处理组中,凋亡细胞比例随着DHT浓度升高而逐渐降低。提示DHT具有拮抗H2O2诱导的细胞凋亡作用,并且这一作用呈现剂量依赖性。

2 MTT法观察细胞活性与正常对照组和高浓度DHT对照组比较,单纯H2O2损伤组OD值显著下降;不同浓度DHT处理组,OD值随着DHT浓度升高而逐渐升高,高浓度DHT处理组OD值与正常对照组和高浓度DHT对照组比较无显著差异。提示实验所用浓度DHT无明显细胞毒作用,并且具有保护细胞活性作用,作用强弱与浓度呈正相关。

3流式细胞仪检测细胞凋亡与正常对照组比较,单纯H2O2损伤组凋亡细胞比例显著增加（49.96%vs2.95%）。不同浓度DHT处理组（0.01,0.1和1μM）凋亡细胞比例明显降低,并且呈剂量依赖性（33.54%、20.04%和6.76%）。正常对照组和高浓度DHT对照组凋亡细胞比例没有显著差异（2.95%vs 3.92%）。提示DHT显著降低H2O2诱导的细胞凋亡,这种保护作用呈现一种剂量依赖性。

4 Western Blot法检测信号分子表达DHT可以抑制H2O2诱导的ECV-304细胞内Caspase-3,Caspase-9和phospho-p38 MAPK的蛋白表达,其中高浓度DHT处理组条带亮度最低,与正常对照组和高浓度DHT对照组接近。提示DHT抑制细胞凋亡的作用可能通过Caspase-3,Caspase-9和phospho-p38 MAPK等信号分子实现。

参考文献

[1]The role of testosterone in the metabolic syndrome:A review[J].Farid Saad,Louis Gooren.Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology.2009(1)

[2]The effects of testosterone on risk factors for,and the mediators of,the atherosclerotic process[J].T.Hugh Jones,Farid Saad.Atherosclerosis.2009(2)

[3]Adrenal androgen dehydroepiandrosterone sulfate inhibits vascular remodeling following arterial injury[J].Masaaki Ii,Masaaki Hoshiga,Nobuyuki Negoro,Ryosuke Fukui,Takahiro Nakakoji,Eiko Kohbayashi,Nobuhiko Shibata,Daisuke Furutama,Tadashi Ishihara,Toshiaki Hanafusa,Douglas W.Losordo,Nakaaki Ohsawa.Atherosclerosis.2009(1)

[4]Gonadal and adrenal androgen deficiencies as independent predictors of increased cardiovascular mortality in men with type II diabetes mellitus and stable coronary artery disease[J].Beata Ponikowska,Ewa A.Jankowska,Jolanta Maj,Kinga Wegrzynowska-Teodorczyk,Bartosz Biel,Krzysztof Reczuch,Ludmila Borodulin-Nadzieja,Waldemar Banasiak,Piotr Ponikowski.International Journal of Cardiology.2009(3)

[5]蓝戈文.二氢睾酮对过氧化氢诱导的ECV-304细胞凋亡的保护作用[D].浙江大学,2009.