细菌基因组 DNA 快速抽提试剂盒的应用

背景^[1-3]

细菌基因组DNA快速抽提试剂盒适用于快速提取各种细菌基因组DNA。采用独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。本试剂盒也可用于食品致病菌(微生物)基因组提取，如：金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、出血性大肠杆菌O157：H7、单增李斯特、沙门氏菌、阪崎肠肝菌等。可从1-5 ml细菌培养液中，快速提取纯化10-40μg纯净的基因组DNA，所得基因组DNA可直接用作PCR模板、酶切、杂交等分子生物学实验。

细菌基因组DNA快速抽提试剂盒

操作步骤

使用前请先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。

1.取细菌培养液1-5 ml，10,000 rpm(~11,500×g)离心1 min，尽量吸净上清。

2.向菌体沉淀中加入200μl缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。

注意：对于较难破壁的革兰氏阳性菌，可略过第2步骤，加入溶菌酶溶液进行破壁处理，具体方法为：加入110µl缓冲液（20 mM Tris,pH 8.0；2 mM Na2-EDTA；1.2%Triton），和70µl溶菌酶溶液（50 mg/ml，客户自备，目录号：RT401），37℃处理30min以上。如果需要去除RNA，可加入4μl RNase A（100 mg/ml）溶液，振荡15 sec，室温放置5 min。

3.向管中加入20μl Proteinase K溶液，混匀。

4.加入220μl缓冲液GB，振荡15 sec，70℃放置10 min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5.加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15 sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

6.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm(~13,400×g)离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7.向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm(~13,400×g)离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8.向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm(~13,400×g)离心30 sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。

9.重复操作步骤8。

10.将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

11.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min，12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，将溶液收集到离心管中。

应用^[4][5]

用于禽多杀性巴氏杆菌基因组重测序、转录组分析及其毒力基因鉴定研究

以禽源多杀性巴氏杆菌强毒株PmC48-1株、Pm72-4株和弱毒株Pm731株为实验材料,对三个菌株进行全基因组测序。

结果表明:PmC48-1株、Pm72-4株和Pm731株基因组全长分别为2,304,775 bp、2,259,533 bp、2,260,636 bp,G+C%含量分别为40.38%、40.28%、40.42%,预测的基因数分别为2131、2028、2068个。

结合已公布的Pm70基因组序列,利用比较基因组学分析获得四个菌株间的差异基因。比较基因组学分析发现:强毒株PmC48-1株含有一个特有基因簇,通过与参考菌株Pm70基因组比较分析发现该基因簇全长44,468 bp,两端含有20 bp与基因PMRS03305（rpL25）的3?端序列同源的定向重复序列,预测基因PMRS03305的3?端是这段基因簇的插入位置;利用PHAST软件分析发现该基因簇包含一个完整的噬菌体序列和一个不完整的噬菌体序列,是一个噬菌体相关基因岛,编码67个Coding sequence（CDS）。

提取强毒株PmC48-1株、Pm72-4株和弱毒株Pm731株RNA,进行RNA-seq分析找出强毒株PmC48-1、Pm72-4与弱毒株Pm731共同的差异表达基因,对共同差异表达基因的上调基因和下调基因分别做GO和KEGG Pathway富集分析,选取部分共同差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证。

结果表明强毒株PmC48-1株和Pm72-4株与弱毒株Pm731株共同差异表达基因有190个,其中75个上调,115个下调。GO富集分析显示这些差异基因在分子功能方面主要涉及催化活性、结合、转运,在细胞组成方面主要涉及膜和细胞组成,在生物学过程方面主要参与细胞过程、代谢过程和定位。KEGG Pathway富集到的通路有碳水化合物代谢、能量代谢、氨基酸代谢、辅酶因子和维生素代谢、膜运输、信号传导、细胞运动性等通路。选取上调基因4个,下调基因8个,经实时荧光定量PCR验证,其与RNA-seq分析结果基本一致。

为了进一步验证Pm强弱毒株的差异毒力基因,分别选取基因组学筛到的PmC48-1株噬菌体相关基因岛上的6个基因（PP00004、PP00009、PP00019、PP00053、PP00060、PP00068）和转录组学筛到的4个上调基因（dppA、fbpA、rsgA-2、PM0472）,共计强弱毒株差异基因10个,进行PmC48-1株单基因突变株的构建。通过同源重组技术筛选双交换突变株,分析双交换突变株的遗传稳定性、生长特性和致病性。结果表明,成功构建10个基因的重组替代质粒,筛选到4个基因（PP00004、PP00009、PP00019、dppA）的双交换突变株,分别命名为PmC48-1Δ4、PmC48-1Δ9、PmC48-1Δ19、PmC48-1ΔdppA。四个突变株连续传代20代后其遗传稳定性良好,体外生长曲线与野生型PmC48-1株基本一致。

参考文献

[1]Genome sequencing of a virulent avian Pasteurella multocida strain GX-Pm reveals the candidate genes involved in the pathogenesis[J].Chengjie Yu,Suolang Sizhu,Qingping Luo,Xuewen Xu,Lei Fu,Anding Zhang.Research in Veterinary Science.2016

[2]Genomic characterization of Pasteurella multocida HB01,a serotype A bovine isolate from China[J].Zhong Peng,Wan Liang,Wenjing Liu,Bin Wu,Biao Tang,Chen Tan,Rui Zhou,Huanchun Chen.Gene.2016

[3]Comparative genome analysis of five Pasteurella multocida strains to decipher the diversification in pathogenicity and host specialization[J].Sezer Okay,Asl?han Kurt K?z?ldo?an.Gene.2015(1)

[4]A unique open reading frame within the comX gene of S treptococcus mutans regulates genetic competence and oxidative stress tolerance[J].Justin Kaspar,Sang‐Joon Ahn,Sara R.Palmer,Sang Chul Choi,Michael J.Stanhope,Robert A.Burne.Molecular Microbiology.2015(3)

[5]曹培丽.禽多杀性巴氏杆菌基因组重测序、转录组分析及其毒力基因鉴定[D].中国农业科学院,2017.