人超敏C反应蛋白(HS-CRP)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人超敏C反应蛋白(HS-CRP)ELISA试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中高敏C反应蛋白（hs-CRP）的含量。

实验原理：试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人超敏C反应蛋白(hs-CRP)水平。用纯化的抗超敏C反应蛋白(hs-CRP)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入人超敏C反应蛋白(hs-CRP),再与HRP标记的超敏C反应蛋白(hs-CRP)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的超敏C反应蛋白(hs-CRP)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中人超敏C反应蛋白(hs-CRP)浓度。

人超敏C反应蛋白(HS-CRP)ELISA试剂盒

操作步骤

1.实验准备：从冰箱取出试剂盒，恢复至室温。浓缩洗涤液用超纯水或蒸馏水稀释20倍，待用。

2.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加洗涤液100μl（不加DON抗体）.余孔分别加标准品或待测样品50μl，然后再加入DON抗体50μl。注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应30分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

3.弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板4次，每次浸泡1-2分钟，200μl/每孔，甩干。

4.每孔加酶标二抗100μl，37℃，30分钟。

5.温育后，弃去孔内液体，甩干，洗板4次，每次浸泡1-2分钟，200μl/每孔，甩干。

6.依序每孔加显色液100μl，37℃避光显色（10分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔显色不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15分钟以内进行检测。

应用^[4][5]

用于老年维持性血液透析（MHD）患者穿透素3（PTX3）与超敏C反应蛋白（hs-CRP）及营养不良的关系的研究

通过检测老年MHD患者PTX3活性,进一步探讨老年MHD患者PTX3与微炎症及营养不良的关系,从而为防治老年MHD患者的营养不良和微炎症提供新的方法。

方法:1.研究对象:共纳入经MHD治疗3个月以上,尿素清除指数（effective urea clearnance time/volume,Kt/V）>1.2的患者共81例,根据年龄分为2组,其中老年组（年龄≥60岁）MHD患者61例,非老年组（年龄<60岁）MHD患者20例。原发病:慢性肾炎31例,高血压肾病24例,糖尿病肾病16例,缺血性肾病1例,多囊肾1例,病因不明8例。同期于健康志愿者18例测取PTX3的医学参考值范围。

2. 收集入选者一般资料:包括年龄、性别、透析龄、原发病、近期是否有感染。

3. 监测项目及参数测定:测量血肌酐（serum creatinine,Scr）、血清白蛋白（albumin,Alb）、血红蛋白（hemoglobin,HB）等指标,采用酶联免疫吸附（ELISA）法测定PTX3,采用免疫透射比浊法测定hs-CRP,≥3mg/L为存在微炎症状态。采用单室模型Kt/V值做为评价所有入选的MHD患者透析充分性的指标。主观综合营养评估（subjective global assessment,SGA）根据包括体重、饮食等多个方面测量:分为良好（SGA1）、轻中度营养不良（SGA2）、重度营养不良（SGA3）。

4. 统计学方法:应用相关统计软件,计数资料应用x2检验。计量资料以均数±标准差表示,成组比较应用t检验。相关分析应用Pearson或Spearman直线相关及偏相关,P<0.05为差异有统计学意义。

结果:1.一般情况比较:共纳入81例患者,其中男性41例,女性40例,平均年龄为65.80±15.21岁（23-91岁）。其中MHD老年组男性（30人,49.18%）与MHD非老年组男性（11人,55.0%）所占比例、老年组Kt/V（1.39±0.14）与非老年组Kt/V（1.35±0.11）、老年组HB（107.02±16.65 g/L）与非老年组（107.85±14.39 g/L）、老年组透析龄（45.85±29.05月）与非老年组（51.35±27.37月）统计学上无明显差异,P>0.05。

2.炎症相关数据比较:老年MHD组的PTX3（3.09±1.19 OD450）及hs-CRP（5.52±3.09 mg/L）明显高于非老年组的PTX3（2.24±0.90OD450）及hs-CRP（4.01±2.19 mg/L）,P<0.05。

3.营养相关数据比较:老年组营养不良42例（68.85%）,显著高于非老年组营养不良9例（45.0%）,P<0.05。老年组Scr（707.31±267.82 mmol/L）、Alb（37.27±4.53 g/L）明显低于非老年组Scr（997.80±137.88 mmol/L）、Alb（41.92±2.77 g/L）,P<0.05。

4.相关性比较:老年组PTX3与hs-CRP呈正相关（r=0.524,P<0.05）,与SGA呈正相关（r=0.417,P<0.05）,与Alb呈负相关（r=-0.479,P<0.05）,与Scr无明显相关性（r=-0.134,P>0.05）。控制性别年龄BMI值行偏相关:老年组PTX3与hs-CRP呈正相关（r=0.532,P<0.05）,与SGA呈正相关（r=0.401,P<0.05）,与Alb呈负相关（r=-0.492,P<0.05）,与Scr无明显相关性（r=-0.208,P>0.05）。

5.血清hs-CRP水平和PTX3对老年MHD组患者存在营养不良的预测:采用hs-CRP预测老年MHD患者营养不良与SGA评价结果比较差异有统计学意义（P<0.05）,提示检测hs-CRP水平与SGA评价效果不同。PTX3预测老年MHD患者存在的营养不良与SGA评价结果比较差别无统计学意义（P>0.05）,提示PTX3评价营养不良与SGA方法评价效果一致。

参考文献

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[2]Correlation between pentraxin-3 and endothelial dysfunction in obstructive sleep apnea syndrome[J].Asiye Kanbay,Elif Kaya,Hakan Büyükoglan,Mehmet Kaya,Zuhal Simsek,Nuri Tutar,Ramazan Demir.Annals of Thoracic Medicine.2015(3)

[3]Re:The Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 is a Key Component of Innate Immunity against Urinary Tract Infection[J].Edward M.Schaeffer.The Journal of Urology.2015(1)

[4]A randomized multicenter trial of paricalcitol versus calcitriol for secondary hyperparathyroidism in stages 3-4 CKD.[J].Coyne Daniel W,Goldberg Seth,Faber Mark,Ghossein Cybele,Sprague Stuart M.Clinical journal of the American Society of Nephrology:CJASN.2014(9)

[5]刘洁琼.老年维持性血液透析（MHD）患者穿透素3（PTX3）与超敏C反应蛋白（hs-CRP）及营养不良的关系的研究[D].承德医学院,2019.