人组蛋白H2B(HISTON-H2B)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人组蛋白H2B(HISTON-H2B)ELISA KIT盒用于检测血清、组织等多种样本中组蛋白H2B(HISTON-H2B)的含量。

检测原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被样本抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的样本呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人组蛋白H2B(HISTON-H2B)ELISA KIT

样品收集、处理及保存方法

1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

应用^[4][5]

用于小鼠CD19胞外区基因和人组蛋白H1e C端基因的克隆及其原核表达研究

根据GenBank登录的小鼠CD19基因序列设计一对引物,通过反转录-聚合酶链式反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）技术,从小鼠脾脏组织总RNA中扩增出一条特异性基因片段,经单酶切鉴定,与GenBank中登录的小鼠CD19基因序列含有相同的单酶切位点。PCR产物分离纯化后连接到pGEX-4T-1载体,经菌液PCR筛选出阳性重组克隆后进行序列测定。结果表明本实验成功的克隆到CD19基因的胞膜外区片段,由918个核苷酸组成,编码306个氨基酸。

所克隆的小鼠MECD19基因与GenBank中登录的小鼠CD19基因相比较,有6个核苷酸的差异,同源性为99.7%。其次,将原核表达重组质粒pGEX-4T-1-MECD19转化到大肠杆菌BL21,经37℃和1.0mmol/L IPTG的诱导,SDS-PAGE凝胶电泳表明所克隆的基因片段在大肠杆菌中得到融合表达,表达出谷胱甘肽-S-转移酶（GST）与MECD19的融合蛋白GST-MECD19,且表达的产物主要以包涵体的形式存在。所获得的融合蛋白分子量分别约为59 KD,与预期结果相符。

最后,通过优化原核表达条件,确定了原核表达重组质粒pGEX-4T-1-MECD19的诱导时间和诱导剂浓度后,对含有pGEX-4T-1-MECD19质粒的BL21菌进行了大量诱导表达,实验中使用反复冻融和超声方法来裂解诱导表达菌,获得了较高浓度的GST-MECD19包涵体蛋白,用十二烷基肌氨酸钠加超声波的方法使包涵体充分溶解,提取了大量的可溶性GST-MECD19原核融合表达蛋白。

综上所述,成功地克隆了小鼠CD19基因的胞外区片段,并进行了原核表达,获得了大量的GST-MECD19原核融合表达蛋白,这些都为进一步研究小鼠CD19分子免疫学功能及其应用提供了试验材料。

组蛋白是真核生物染色体（质）中含量最高的结构蛋白,其总量与染色体DNA大致相等。组蛋白属于碱性蛋白质,等电点一般在pH10.0以上,能与带有负电荷的DNA分子紧密结合。

按组成中精/赖氨酸的比例,组蛋白可被分为五种:H1、H2A、H2B、H3、H4。H1组蛋白由220个氨基酸组成,分子量较大,进化中不如其它组蛋白那么保守,哺乳类细胞的组蛋白H1约有8种密切相关的,氨基酸系列上稍有不同的亚型,H1组蛋白在构成核小体时起连接作用,可赋予染色质以极性,与核小体包装成更高一级结构的过程相关。

根据GenBank登录的人组蛋白Histl H1e基因序列设计一对引物,先通过提取人基因组DNA,再利用PCR技术,从人基因组DNA中扩增出一条特异性基因片段。PCR产物分离纯化后连接到pET-32a载体,经菌液PCR筛选出阳性重组克隆后进行序列测定。

参考文献

[1]Clinicopathologic Significance of Loss of CD19 Expression in Diffuse Large B-Cell Lymphoma[J].Miho Kimura,Motoko Yamaguchi,Shigeo Nakamura,Hiroshi Imai,Satoshi Ueno,Shoko Ogawa,Kana Miyazaki,Kouji Oka,Toshiyuki Ohno,Kenkichi Kita,Tohru Kobayashi,Hiroshi Shiku.International Journal of Hematology.2007(1)

[2]Histone H2A as a transfection agent in crayfish hematopoietic tissue cells[J].Developmental and Comparative Immunology.2006(4)

[3]Anti-CD19 immunotoxin enhances the activity of chemotherapy in severe combined immunodeficient mice with human pre-B acute lymphoblastic leukemia[J].L.Herrera,C.Stanciu-Herrera,C.Morgan,V.Ghetie,E.S.Vitetta.Leukemia&Lymphoma.2006(11)

[4]Structure of the genes encoding the CD19 antigen of human and mouse B lymphocytes[J].Liang-Ji Zhou,David C.Ord,Sidne A.Omori,Thomas F.Tedder.Immunogenetics.2004(2)

[5]王静.小鼠CD19胞外区基因和人组蛋白H1e C端基因的克隆及其原核表达[D].安徽农业大学,2007.