人前列腺癌细胞的应用

背景^[1-3]

人前列腺癌细胞是从一名50岁的明确诊断为转移性前列腺癌的白人男性患者的左锁骨上淋巴结细针穿刺的活体组织中分离建立的。5-α-双氢睾酮可影响该细胞的生长和酸性磷酸酶的产生。该细胞不形成均一的单层而是成簇生长，所以传代的时候要反复吹打形成单个细胞；该细胞贴壁不牢，达不到汇合状态，而且会使培养基迅速变酸；传代后48h内一定要保持培养瓶静止.如果此时挪动培养瓶，会使大部分细胞从瓶底脱落。如果出现此种情况，需要重新孵育24~48h使细胞重新贴壁，细胞贴壁后可更换培养基。

人前列腺癌细胞

细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议客户冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

应用^[4][5]

用于潜在IL-6抑制剂姜黄素抗人前列腺癌细胞作用研究

姜黄素对人前列腺癌细胞（DU145、LNCAP）的增殖、凋亡及自噬的影响及其对IL-6/JAK2/STAT3通路表达的影响。

方法：1.使用SRB法检测不同浓度,不同时间点姜黄素对人前列腺癌细胞系（DU145、PC-3、LNCAP）增殖抑制的影响。

2. 使用平板克隆实验检测不同浓度姜黄素对人前列腺癌细胞系（DU145、LNCAP）克隆形成能力的影响。

3. 荧光显微镜观察不同时间药物作用细胞,镜下观察细胞生存状态并拍照。

4. 通过EdU染色法检测不同浓度姜黄素作用下对人前列腺癌细胞系（DU145、LNCAP）增殖的影响。

5. 通过蛋白免疫印迹法检测姜黄素作用对前列腺癌细胞IL-6/JAK2/STAT3通路中相关因子表达的影响。

6. 通过蛋白免疫印迹法检测姜黄素对前列腺癌细胞相关凋亡蛋白表达情况。

7. 通过蛋白免疫印迹法检测姜黄素对前列腺癌细胞相关自噬因子表达情况。

8. 通过蛋白免疫印迹法检测姜黄素可能通过IL-6/JAK2/STAT3通路调控前列腺癌细胞凋亡、自噬。

结果：1.SRB实验检测结果表明:姜黄素对人前列腺癌细胞系的增殖展现出明显的抑制作用,且该作用具有一定的药物浓度、时间依赖性。

2. 平板克隆实验结果表明:姜黄素处理组与对照组相比,细胞克隆形成能力明显减弱,增殖受到明显的抑制,具有药物浓度依赖性。

3. 荧光显微镜下观察拍照发现,随着姜黄素作用时间的延长,细胞形态开始缩小变圆,局部发现有细胞融合,坏死细胞崩解的现象,坏死细胞增多,表明药物对细胞的杀伤能力也加大,与SRB结果一致。

4. 细胞在不同浓度姜黄素作用24 h后采用EdU试剂盒检测细胞增殖情况,与对照组相比,可以发现视野中红色荧光要少于对照组,且与浓度成正比。

5. 蛋白免疫印迹法实验结果显示:姜黄素处理两种细胞IL-6/JAK2/STAT3通路中p-JAK2、p-STAT3的相对表达均有不同程度的减弱。

6. 蛋白免疫印迹法实验结果显示:药物处理前列腺癌细胞株与对照组相比,不同浓度的姜黄素处理细胞后,PARP1、Cleaved-caspase3的蛋白表达量均明显增加,Bcl-2的蛋白表达量显著减少;相同浓度的姜黄素处理不同时间后,前列腺癌细胞株中PARP1、Cleaved-caspase3的裂解片段蛋白表达量随时间均明显增加,Bcl-2的蛋白表达量随时间均显著减少。

7. 蛋白免疫印迹法实验结果显示:选取药物处理前列腺癌细胞株,与对照组相比,不同浓度的姜黄素处理细胞后,Beclin-1、LC3B的蛋白表达量均明显增加;相同浓度的姜黄素处理不同时间后,前列腺癌细胞株中Beclin-1、LC3B的蛋白表达量均明显增加。

8.蛋白免疫印迹法实验结果显示:在姜黄素作用下PARP1、Cleaved-caspase3、Beclin-1,LC3B的蛋白表达量明显上升,Bcl-2的蛋白表达量显著减少,IL-6+Cur共同作用后其表达量有一定程度的回复,姜黄素可能通过IL-6/JAK2/STAT3通路调控前列腺癌细胞凋亡、自噬。

参考文献

[1]Enhanced anti-tumor effects of the PD-1 blockade combined with a highly absorptive form of curcumin targeting STAT3.[J].Hayakawa Taeko,Yaguchi Tomonori,Kawakami Yutaka.Cancer science.2020(12)

[2]Genetic Interleukin 6 Signaling Deficiency Attenuates Cardiovascular Risk in Clonal Hematopoiesis.[J].Bick Alexander G,Pirruccello James P,Griffin Gabriel K,Gupta Namrata,Gabriel Stacey,Saleheen Danish,Libby Peter,Kathiresan Sekar,Natarajan Pradeep.Circulation.2020(2)

[3]Docetaxel Combined with Thymoquinone Induces Apoptosis in Prostate Cancer Cells via Inhibition of the PI3K/AKT Signaling Pathway[J].Santosh Kumar Singh,Tejumola Apata,Jennifer B.Gordetsky,Rajesh Singh.Cancers.2019(9)

[4]Current Treatment Options for Metastatic Hormone-Sensitive Prostate Cancer[J].Carlo Cattrini,Elena Castro,Rebeca Lozano,Elisa Zanardi,Alessandra Rubagotti,Francesco Boccardo,David Olmos.Cancers.2019(9)

[5]赵瑾宜.潜在IL-6抑制剂姜黄素抗人前列腺癌细胞作用研究[D].昆明医科大学,2021.