梅毒甲苯胺红不加热血清试验诊断试剂的应用

背景^[1-3]

梅毒甲苯胺红不加热血清试验诊断试剂用性病实验室玻片试验（VDRL）抗原重悬于含有甲苯胺红的特制溶液中制成，检测人血清或血浆中的反应素，用于临床辅助诊断梅毒。

基本原理:用正常牛心肌的心类脂（Cardiolipin二磷酸酰甘油衍生物）作为抗原，而不是用螺旋体作为抗原，来测定病人血清中的反应素（非特异性抗体---抗心磷脂抗体）。用来初步筛查梅毒螺旋体感染。反应素在初期梅毒病灶出现后1~2周就可测出，在二期梅毒滴度最高，三期梅毒较低。

梅毒甲苯胺红不加热血清试验诊断试剂

梅毒是一种由梅毒螺旋体(TP)引起全身各器官的性传播疾病，当梅毒螺旋体进入人体3~6周后，可在患者血清中检出2种抗体，一种是针对螺旋体抗原的抗体，另一种是针对非螺旋体抗原的抗体。临床梅毒检测常用的血清学试验分为非梅毒螺旋体抗原试验(如VDRL,TRUST,RPR)和梅毒螺旋体抗原试验(如TPPA,ELISA等)。

梅毒螺旋体感染人体后，宿主迅速对螺旋体表面的脂质作出免疫应答，在3~4周产生抗类脂质抗原的抗体（反应素），此时TRUST试验可呈阳性。

TRUST法适用于梅毒筛查，其定量试验可作为疗效评价，但风湿、红斑狼疮患者可与之发生交叉反应。

TP-ELISA双抗原夹心法敏感性高于TRUST,RPR法，价格低，且操作简单方便，仪器操作规范，便于资料保存，适用于样本量大的体检及流行病学的调查。

TPPA方法特异性好，适用于梅毒筛查后阳性标本的确证，不宜作为梅毒筛查及疗效判断。WHO推荐用VDRL和RPR法对血清进行过筛试验，出现阳性者用TPPA,TPHA等方法做确证试验。

RPR法和TRUST法存在不同程度的假阳性，从医疗单位避免医疗纠纷和患者减少心理压力及家庭矛盾两方面考虑，标本的检测采用ELISA和TRUST双法筛查，阳性标本再用TPPA方法进行生物学假阳性甄别。

应用^[4][5]

用于HIV感染者梅毒筛查流程及梅毒螺旋体膜蛋白Tp47对HIV经生殖道感染影响的研究

为评价不同的梅毒筛查流程对HIV感染者梅毒血清检测阳性率的影响,我们根据样本量计算公式N=Zα2P（1-P）/δ2,结合HIV感染患者梅毒大致流行率及3%误差和95%的置信区间,估算一共至少需要677份样本。

收集了865例HIV感染者血清,对每个样本同时进行梅毒甲苯胺红加热血清诊断试验（TRUST）、梅毒螺旋体血凝试验（TPPA）和酶联免疫法检测梅毒螺旋体抗体试验（TP-ELISA）,按照三种不同的筛查流程分别计算梅毒血清检测阳性率,将结果进行McNemar’s检验分析。

结果表明,865例样本中,反向筛查流程的梅毒血清检测阳性率为24.9%,传统筛查流程的阳性检出率为14.2%,两者之间差异有统计学意义（P<0.0001）;反向筛查流程与ECDC筛查流程的总符合率为99.8%。

目前梅毒检测过程中,存在血清固定、在感染初期尚未出现抗体导致假阴性等问题。为了建立一种用于检测梅毒抗原的方法以早期、便捷辅助诊断梅毒,本研究制备了抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47单克隆抗体。

首先利用基因重组技术表达、纯化TP47蛋白,将其免疫BALA/c小鼠,采用杂交瘤融合技术获得了5株抗Tp47蛋白的单抗。1E2B4株为IgG2a型,其余四株均为IgGI型,其中1E2B4株抗体效价最高,经ELISA测定达1:4x105。经Western Blot、免疫共沉淀实验鉴定,5株抗体对靶抗原识别具有良好的特异性。利用1B3F2株和1E2B4株初步建立了ELISA、胶体金试纸条的方法检测重组Tp47蛋白,其中ELISA的灵敏度为6ng/ml,特异性好,具有潜在的临床应用价值。

为了探索梅毒螺旋体感染对HIV经生殖道感染的影响及相关机制,利用梅毒螺旋体主要的膜蛋白Tp47刺激宫颈内膜细胞End1/E6E7来模拟梅毒螺旋体对HIV在生殖道黏膜传播的影响。经Tp47蛋白刺激后,End1/E6E7细胞在蛋白、mRNA水平上均有IL-6、IL-8表达升高（p<0.05）,同时增加了HIV感染后细胞内病毒抗原水平（p<0.05）。

HIV感染经Tp47预处理的End1/E6E7与单纯感染病毒组相比,mRNA二代测序筛选出其上调的差异基因涉及的生物学过程主要富集在“调节细胞因子合成”、“调节与免疫相关的细胞因子”、“细胞运动”、“蛋白进入”相关,经定量PCR验证,转录组测序结果可信度高。

结论:（1）在HIV感染者中建议采用反向或者ECDC筛查流程来筛查梅毒,传统筛查流程可能严重低估HIV感染者的梅毒血清检测阳性率。

（2）本研究制备的抗Tp47单克隆抗体能敏感且特异地识别Tp47蛋白,利用自主研发的抗Tp47单抗,初步建立了ELISA、胶体金试纸条检测重组TP47蛋白,在梅毒抗原诊断方面具有潜在的应用前景。

（3）梅毒螺旋体膜蛋白Tp47可能通过促进炎症因子的表达来增强HIV经生殖道传播。

参考文献

[1]HIV internalization into oral and genital epithelial cells by endocytosis and macropinocytosis leads to viral sequestration in the vesicles[J].Aizezi Yasen,Rossana Herrera,Kristina Rosbe,Kathy Lien,Sharof M.Tugizov.Virology.2018

[2]Effect of HSV-2 infection on subsequent HIV acquisition:an updated systematic review and meta-analysis[J].Katharine J Looker,Jocelyn A R Elmes,Sami L Gottlieb,Joshua T Schiffer,Peter Vickerman,Katherine M E Turner,Marie-Claude Boily.The Lancet Infectious Diseases.2017(12)

[3]Role of sex hormones and the vaginal microbiome in susceptibility and mucosal immunity to HIV-1 in the female genital tract[J].Danielle Vitali,Jocelyn M.Wessels,Charu Kaushic.AIDS Research and Therapy.2017(1)

[4]Genital—Systemic Chemokine Gradients and the Risk of HIV Acquisition in Women[J].Lenine J.P.Liebenberg,Lindi Masson,Kelly B.Arnold,Lyle R.Mckinnon,Lise Werner,Elizabeth Proctor,Derseree Archary,Leila E.Mansoor,Douglas A.Lauffenburger,Quarraisha Abdool Karim,Salim S.Abdool Karim,Jo-Ann S.Passmore.JAIDS Journal of Acquired Immune Deficiency Syndr.2017(3)

[5]陈彬.HIV感染者梅毒筛查流程及梅毒螺旋体膜蛋白Tp47对HIV经生殖道感染影响的研究[D].浙江大学,2019.