血清淀粉样蛋白A(SAA)重组蛋白的应用

背景^[1-3]

血清淀粉样蛋白A(SAA)重组蛋白是一种非特异性急性时相反应蛋白，其作为炎症标志物的临床价值近年来得到广泛关注。SAA水平变化对于感染性疾病的早期诊断、危险评估、疗效观察及预后评价都具有重要临床价值。除了在细菌感染中升高外，SAA在病毒感染中亦显著升高，根据其升高的程度或与其他指标联合运用，可以提示细菌性或病毒性感染，从而弥补了目前常用炎症标志物不能提示病毒感染的不足。

血清淀粉样蛋白A(SAA)是一种非特异性急性时相反应蛋白，其作为炎症标志物的临床价值近年来得到广泛关注。SAA水平变化对于感染性疾病的早期诊断、危险评估、疗效观察及预后评价都具有重要临床价值。除了在细菌感染中升高外，SAA在病毒感染中亦显著升高，根据其升高的程度或与其他指标联合运用，可以提示细菌性或病毒性感染，从而弥补了目前常用炎症标志物不能提示病毒感染的不足。

血清淀粉样蛋白A(SAA)重组蛋白免疫组化

人体A-SAA主要在肝脏中合成，由细胞因子IL-1β，IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导，这些细胞因子可以与糖皮质激素协同作用以增强A-SAA产生。另外，研究发现，在未患任何疾病的肥胖个体者的脂肪细胞中可见大量的A-SAA mRNA表达，这意味着A-SAA并不只在肝脏合成。

SAA具有以下生物学功能:

(1)SAA具有促炎活性，在SAA质量浓度低至10μg/L时，具有诱导趋化因子和趋化白细胞迁移的能力;

(2)SAA已被描述为血管生成蛋白，在SAA质量浓度大于10～60 mg/L时，可以刺激内皮细胞增殖、黏附、侵袭和形成的毛细管样结构，刺激体内新血管形成;

(3)SAA在生理水平通过结合外膜蛋白A作为革兰阴性菌的调理素，从而增强细菌的吞噬作用，并且能够在合成、重建细胞膜时形成离子通道，干扰细胞离子稳态并引起细菌裂解;

(4)SAA具有抗病毒活性，但这种抗病毒活性可能限于丙型肝炎病毒;

(5)SAA具有诱导基质降解酶的能力;

应用^[4][5]

用于血清淀粉样蛋白A1对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响及其机制的实验研究

目的：1.通过转染SAA1慢病毒,明确SAA1高表达对AS斑块稳定性的影响；2.探讨SAA1慢病毒转染对斑块内脂质、巨噬细胞、平滑肌细胞及胶原的影响；3.通过体内外实验明确SAA1对胶原表达的影响及其相关信号通路。

研究方法：1.SAA1高表达慢病毒的构建获取目的基因后,经RT-PCR扩增后将目的基因片段与慢病毒载体plenti6.3-MSC-IRES-EGFP连接,构建成plenti6.3-SAA1-IRES-EGFP,并经转化、包装后测定慢病毒的滴度,用于实验。

2. 动物饲养及建模将100只6-8周龄的雄性ApoE-/-小鼠适应性喂养1周,给予颈动脉套管。继续高脂喂养8周后,随机将剩余的95只ApoE-/-小鼠分为4组:Control组（n=23）、lenti-null组(n=25、low-lenti-SAA1组（n=23）及high-lenti-SAA1组（n=24）。Lenti-null组给予1x107TU空慢病毒载体,low-lenti-SAA1组给予1×107TUSAA1高表达慢病毒,high-lenti-SAA1组1×109TUSAA1高表达慢病毒,control组给予相同体积生理盐水。继续高脂喂养4周后,小鼠空腹12小时,称体重,以0.8%戊巴比妥麻醉,打开胸腔,心脏取血,置于-80度冰箱保存,以备后续检测。以生理盐水灌洗心脏和主动脉,冲洗出残余血液。部分动物继以4%多聚甲醛固定直至肝脏变硬,收集小鼠套管近端的颈动脉,以4%多聚甲醛浸泡24小时。其余部分动物的颈动脉标本置于-80度冰箱保存。

3. 酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）以ELISA法检测血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、甘油三脂及TNF-α、IL-6的浓度。

4. 颈动脉油红O染色对小鼠颈动脉进行5μm连续切片,每10张取1张用于油红O染色,病变的严重程度用斑块占颈动脉斑块面积的百分比来表示。

5. 组织免疫组织化学染色对冰冻切片行SAA1、α-SMC actin、MOMA-2、胶原I、胶原Ⅲ、TGF-β1、MMP1、MMP8免疫组化染色观察SAA高表达对斑块SAA、α-SMC actin、MOMA-2、胶原I、胶原Ⅲ、TGF-β1、MMP1、MMP8的影响。

6. Western blot检测定量称取冻存组织,或收集细胞,提取蛋白,采用western blot法,以GAPDH为内参检测SAA1、胶原I、胶原Ⅲ、TGF-β1、MMP1、MMP8、MMP2、MMP9的表达；以相应非磷酸化状态为内参检测p-p38、ERK1/2、JNK、Smad2、Smad3的表达。

7. 实时定量PCR（real-time PCR）检测定量称取冻存组织,Trizol法提取总RNA,经过逆转录后以18S为内参检测SAA1的表达,以确定SAA1高表达慢病毒的转染效果。

8. 免疫荧光染色重组SAA1蛋白刺激平滑肌细胞后,免疫荧光法检测胶原I、胶原III、MMP1和MMP8的表达。

9. 统计学分析所有数值均以均数±标准差表示。对数据进行正态分布检验,正态分布的计数资料应用Student t检验,多组采用方差分析（ANOVA）,非正态分布的资料行Mann-Whitney检验。设P<0.05有统计学差异。

结果：各组小鼠的一般情况Control组（n=23）、lenti-null组（n=25）、low-lenti-SAA1组（n=23）及high-lenti-SAA1组（n=24）ApoE-/-小鼠的体重及血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的水平浓度无差异（P>0.05）。表明SAA1高表达慢病毒的局部转染,没有影响小鼠体内整体的脂质代谢。2.plenti6.3-SAA1-IRES-EGFP慢病毒转染对血清SAA1及其他炎症因子表达的影响Control组、lenti-null组、1ow-lenti-SAA1组的血清SAA1表达几乎没有变化,high-lenti-SAA1组的血清SAA1表达略高于前三组,但尚未达到统计学差异（P>0.05）；这四个组的炎症因子TNF-α、IL-6在血清中的分泌表达也未达到统计学差异（P>0.05）。表明慢病毒的局部转染,没有引起小鼠体内显著的炎症反应。

参考文献

[1]Urotensin II-induced collagen synthesis in cultured smooth muscle cells from rat aortic media and a possible involvement of transforming growth factor-β1/Smad2/3 signaling pathway[J].Jing Zhao,Wenhui Ding,Nana Song,Xiao Dong,Beibing Di,Fen Peng,Chaoshu Tang.Regulatory Peptides.2013

[2]Downregulation of type I collagen expression in silibinin-treated humanskin fibroblasts by blocking the activation of Smad2/3-dependent signaling pathways:Potential therapeutic use in the chemoprevention of keloids[J].Jae-We Cho,Kwon-Jun Il,Kyu-Suk Lee.International Journal of Molecular Medicine.2013(5)

[3]Feline serum amyloid A protein as an endogenous Toll-like receptor 4 agonist[J].Takashi Tamamoto,Koichi Ohno,Yuko Goto-Koshino,Hajime Tsujimoto.Veterinary Immunology and Immunopathology.2013

[4]The role of NF-кB in SAA-induced peroxisome proliferator-activated receptorγactivation[J].Hongzhe Li,Shu Qin Ooi,Chew-Kiat Heng.Atherosclerosis.2013(1)

[5]李波.血清淀粉样蛋白A1对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响及其机制的实验研究[D].山东大学,2014.