血清淀粉样P物质(SAP)重组蛋白的应用

背景^[1-3]

血清淀粉样P物质(SAP)重组蛋白是一种小的非纤维状的糖蛋白。为五角形结构。是许多基底膜的组成成分。常在血清和多数淀粉样沉积物中出现。能调节免疫反应，抑制弹性蛋白酶，是肝脏损伤的标志。

血清淀粉样P物质(serum amyloid P component,SAP),作为一种古老的蛋白质,与C反应蛋白(CRP)构成血清正五聚蛋白家族,其系统发生学非常保守,表明具有重要生理功能。

血清淀粉样P（Serum amyloid P,SAP）物质与C反应蛋白（C reactive protein,CRP）和正五聚蛋白3（pentraxin 3,PTX3）同属正五聚体家族,它们与炎症免疫反应有着不可分割的联系。最初SAP是作为一种淀粉样沉积蛋白为人们所认识,认为其在系统性淀粉样变性疾病的发生发展中有着重要作用,后来,研究逐渐发现SAP参着与体内的固有免疫、炎症反应、淀粉样变等多种活动,近年来SAP在心血管方面的作用也渐渐为人们所认识。

血清淀粉样P物质(SAP)重组蛋白

重组蛋白表达是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术。在基因工程技术中占有核心地位。编辑本段蛋白表达系统概述蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系。通过这个体系可以实现外源基因在宿主中表达的目的。一般由以下几个部分组成:

1、宿主。表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特性不同,适合表达蛋白的种类也不相同。

2、载体。载体的种类与宿主相匹配。根据宿主不同,分为原核(细菌)表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。载体中含有外源基因片段。通过载体介导,外源基因可以在宿主中表达。

3、辅助成分。有的表达系统中还包括了协助载体进入宿主的辅助成分。

应用^[4][5]

用于血清淀粉样P物质对巨噬细胞炎症反应以及氧化应激的影响及机制研究

通过不同浓度的SAP作用RAW264.7细胞,观察SAP对RAW264.7分泌炎症因子、产生氧化应激产物等的影响,并且观察其对炎症相关的机制蛋白的影响,探寻SAP对炎症免疫反应作用的可能机制。

研究方法1.细胞培养与实验分组：细胞接种于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM完全培养基,在每次实验前将巨噬细胞密度调整为1×10+个／孔,加入6孔板中,无血清培养基饥饿24h后,对照组不予以处理,SAP组加入不同浓度SAP刺激24h后,收取样本检测。实验分为4组：1)空白对照组,2)SAP 1.25ug/ml组,3)SAP 2.5ug/ml组,4)SAP 5ug/ml组。

2.不同浓度的SAP对RAW264.7细胞炎症反应和氧化应激的影响用不同浓度的SAP作用RAW264.7细胞24h后,收集细胞上清,用ELISA检测细胞上清炎症因子白介素1-β（interleukin-1β）、肿瘤坏死因子-a（Tumor Necrosis Factor-a,TNF-a）以及氧化应激指标一氧化氮（Nitric Oxide,NO）的分泌,用流式细胞术检测细胞表面细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1）及炎症相关Fcy受体的表达,并用RT-PCR复测IL-1β、TNF-a及ICAM-1 mRNA的表达。

3.不同浓度的SAP对炎症相关机制蛋白的影响用不同浓度的SAP作用RAW264.7细胞24h后,RIPA裂解液裂解细胞提取蛋白,用蛋白质印迹法（Western Blot）检测Fcγ受体通路下游蛋白脾酪氨酸蛋白激酶（spleen tyrosine kinase,Syk）的表达,以及炎症相关的MAPK家族蛋白细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK 1/2）、磷酸化ERK1/2（pERK）的表达。

4.统计学处理所有计量资料均以均数±标准差（x±s）表示,并采用SPSS20.0统计软件进行两样本均数比较的独立样本t检验分析,多组间总体均数比较,在方差齐时采用单向方差分析（one-way ANO VA）,方差不齐时采用Welch校正检验。多个样本均数间的多重比较方差齐时采用LSD法检验,方差不齐时采用Dunnett’s T3检验,P<0.05为差异有统计学意义。

研究结果1.不同浓度的SAP对细胞上清中IL-1β、TNF-α、ICAM-1及活性氮NO的分泌的影响结果显示,SAP可促进炎症因子IL-1β、TNF-α、ICAM-1以及活性氮NO的分泌,且这种作用有一定的浓度依赖性。与空白对照组相比,SAP三组中IL-1β的表达量均明显升高,2.5ug/ml及5ug/ml组的fNF-a相较对照组与1.25ug/ml组均有明显升高趋势,5ug/ml组的ICAM-1和NO分泌相较于对照组和1.25ug/ml组均明显升高,结果具有统计学意义,其余几组之间并无统计学差异,但是仍有随浓度升高分泌增加的趋势。

2. 不同浓度SAP对炎症因子IL-1β、TNF-α、ICAM-1 mRNA表达的影响结果显示,与空白对照组相比,加入SAP刺激之后,三种炎症因子的nRNA表达量均有明显增高,且有一定的浓度依赖性。5ug/ml组的三种炎症因子分泌与其他三组之间均有明显升高趋势,2.5ug/ml组的IL-1β、TNF-α的mRNA表达相较于空白对照组和1.25ug/ml组均有升高,结果均具有统计学意义,其余几组之间并无统计学差异,但是仍有随浓度升高分泌增加的趋势。

3.不同浓度的SAP对炎症相关机制蛋白的影响SAP刺激后Syk明显增加,相较于空白对照组,1.25ug/ml、2.5ug/ml、5ug/ml组Syk表达量明显增加,差异具有统计学意义,且2.5ug/ml组与5ug/ml组相较1.25ug/ml组Syk表达量亦有升高,差异具有统计学意义。而SAP作用后Fcγ受体、pERK 1/2的表达并无明显改变,和空白对照组相比并无统计学意义。

参考文献

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[5]刘季晨.血清淀粉样P物质对巨噬细胞炎症反应以及氧化应激的影响及机制[D].南方医科大学,2016.