人抗乙型肝炎病毒表面抗体(HBSAB)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人抗乙型肝炎病毒表面抗体(HBSAB)ELISA KIT可以用于检测各种样本中人抗乙型肝炎病毒表面抗体(HBSAB)的含量。

原理：试剂盒采用间接法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人抗乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）捕获抗原的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的人抗乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人抗乙型肝炎病毒表面抗体(HBSAB)ELISA KIT

样品收集、处理及保存方法

1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

操作步骤

1. 从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3. 待测样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；

4. 随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

应用^[4][5]

用于人源抗乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）基因工程抗体的研究

目前应用于临床的高效价免疫球蛋白（HBIG）采用健康人即抗-HBsAg阳性的人血制备的,可以中和并清除侵入人体的乙肝病毒,使机体免受乙肝病毒的感染。由于血源来源有限、制备成本高且存在病原体潜在感染的危险,限制了其在临床上的应用。抗体库技术能够筛选出高亲和力的特异性单克隆抗体,从而使大规模生产人源化乙肝抗体成为可能。

基于此,研究中筛选人源抗HBsAg抗体包括以下三部分内容：一、人源抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌体抗体库的构建和筛选选取5名乙肝表面抗体（HBsAb+）阳性的健康志愿者,接种国产乙肝疫苗进行加强免疫,两周后采集志愿者外周血并分离出淋巴细胞,提取细胞总RNA,使用Oligo dT引物逆转录合成cDNA,利用特异性的8对Lambda轻链子库引物、5对Kappa轻链子库引物和8对重链引物扩增出轻重链Fd片段,轻链和重链分别通过SacⅠ/XbaⅠ和Xhol/SpeⅠ酶切位点克隆到pComb3H载体中,成功电转构建4个Kappa子库和Lambda子库,细菌抗体库鉴定结果表明所构建Fab噬菌体抗体库库容量达到3×108以上,抗体基因插入率接近100%,符合筛库的标准。在成功构建了噬菌体抗体库的基础上,采用辅助噬菌体VCSM13包装成Fab噬菌体抗体库,利用商品化的乙肝表面抗原蛋白对抗体库进行富集筛选。并通过序列测定确定所获各株抗体的基因序列,与v-base database中抗体序列信息进行比较,确定其CDR区。序列测定结果显示共有20株轻重链系列均不相同的克隆株,通过ELISA实验证明这些抗体均为特异性HBsAg抗体,通过竞争性ELISA发现20株抗体可以竞争结合3个不同表位。

二、人源抗乙型肝炎病毒表面抗原全抗体表达及功能鉴定在利用原核细胞XL1-Blue表达Fab抗体的基础上,分别利用哺乳动物瞬时表达系统和杆状病毒-昆虫细胞技术平台实现了全抗体的真核分泌表达。将筛选出的20株抗体中具有高滴度6株Fab抗体的轻链和重链Fd段基因插入杆状病毒载体pAc-L-FcR中,然后将构建完成的重组质粒与杆状病毒重组后转染昆虫细胞,同时将其轻重链可变区基因插入HL51-14哺乳动物细胞表达载体后,转染293T细胞。通过直接免疫荧光检测真核表达效果,收集昆虫细胞和哺乳动物细胞表达上清进行亲和层析纯化。利用SDS-PAGE检测纯化后抗体的纯度、ELISA方法检测纯化后的抗HBsAgIgG全抗体的功能活性,结果表明纯化后的人源HBsAg单克隆抗体抗体纯度达到98%以上,并且具有良好的生物活性。

三、人源抗乙型肝炎病毒表面抗原IgG全抗体亲和力研究将纯化后的抗HBsAg IgG全抗体分别利用非竞争性ELISA方法和BIAcoreSPR检测方法检测其亲和力,结果显示含有同一重链基因的各株抗体的亲和力较高,KD值达到10-9mol/L（abbr.M）,而两种表达系统表达的同一株抗体的亲和力活性无明显差异。综上所述,本研究通过基因工程抗体制备技术平台,运用噬菌体表面呈现技术,从乙肝疫苗加强免疫后的HBsAb+志愿者的外周血中获得Fab段抗体基因,成功构建了人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体文库,容量为2×107克隆/ml,轻、重链基因插入率均接近100%。用商品化的乙肝病毒表面抗原对Fab噬菌体抗体库进行富集筛选,经过特异性ELISA、序列测定证实共获得了20株特异性针对乙肝病毒表面抗原的人源Fab单抗,滴度测定后选取6株滴度较高的抗体进行全抗体表达。

参考文献

[1]Epidemiology of Hepatitis Virus B and C[J].Archives of Medical Research.2007(6)

[2]Mechanism of viral persistence and resistance to nucleoside and nucleotide analogs in chronic Hepatitis B virus infection[J].Fabien Zoulim.Antiviral Research.2004(1)

[3]Baculovirus expression cassette vectors for rapid production of complete human IgG from phage display selected antibody fragments[J].Mifang Liang,Stefan Dübel,Dexin Li,Iris Queitsch,Wei Li,Ekkehard K.F Bautz.Journal of Immunological Methods.2001(1)

[4]Efficacy and limitations of a specific immunotherapy in chronic hepatitis B[J].Journal of Hepatology.2001(6)

[5]刘洋.人源抗乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）基因工程抗体的研究[D].中国疾病预防控制中心,2012.