灵芝麦角硫因高通量检测方法研究

前言

麦角硫因(ergothioneine,EGT)又名为2-硫基-L-组氨酸三甲基内盐，是存在于很多动植物体内含量丰富的天然氨基酸，仅在部分微生物(放线菌、链霉菌)、蕈菌、某些蓝细菌中合成，不能由动物机体自身合成EGT，人体只能从食物中摄入并通过高特异性的有机阳离子转运蛋白1型(organic cation transpoter novel type-1,OCTN1)在各种细胞和组织中积累高浓度EGT。EGT被认为是一种很强的抗氧化剂，Servillo等对其抗氧化机理进行了探讨，认为其拥有独特的氧化还原机制，并提出了一种EGT在细胞中的独特抗氧化作用。EGT的标准氧化还原电位是-0.06V，其它硫醇的电势一般在-0.32V～-0.2V之间，因此EGT在生理pH环境下比其他抗氧化剂更稳定，不易自发氧化。研究表明，EGT具有多种重要的生理功能，如抗炎作用；通过保护DNA实现的细胞保护功能；通过促进神经细胞分化作用促进神经新生达到的抗抑郁功能；通过抵抗氧化应激实现的眼睛保护功能；通过中断与动脉粥样硬化发生相关的黏附分子表达实现的心脑血管保护功能；通过抑制毒性达到的对神经退行性疾病的预防和治疗作用等，且本身具有安全性，因此，EGT在医药、食品和化妆品等行业具有广泛的应用前景。

EGT生产方式有化学合成、食用菌提取及微生物发酵等，由于前两者成本较高，工序复杂，因此食用菌菌丝的深层发酵是目前EGT工业化生产的主流模式，但自然菌株EGT产量低，需要通过育种技术培育EGT高产工业化菌种，培育工业食用菌菌种的方法有诱变育种、杂交育种、基因工程育种及原生质体融合育种等，但每种育种方法都需要进行多次、大样本量EGT含量检测，需说明的是，育种过程中EGT含量检测的意义更多在于比较样本间含量高低。目前EGT的检测方法有高效液相色谱法、高效毛细管电泳法和薄层电泳法等。使用最为广泛的是高效液相色谱法，该方法可以从物质复杂的体系中准确检测出EGT的含量，但高效液相色谱法有其明显缺陷，即需探索针对不同样品不同的检测条件，且由于EGT出峰时间晚，标品昂贵，在育种需从大量样本中筛选出高产样本的情况下会导致检测耗时过长，成本过高，极大地阻碍了EGT的开发与应用研究，因此，急需建立一 种可准确测定样本间EGT浓度的高通量快速检测方法。

由于EGT具有强抗氧化性，2价铁离子还原性适中(既不会受空气中氧气接触干扰，也不会因为还原性太弱导致指示性降低)，EGT能与2价铁离子反应生成无色螯合物，同时硫氰酸根离子与二价铁离子反应生成红色络合物，根据以上特点，本研究选用硫氰酸铁为还原剂，使用麦角硫因标准品与硫氰酸铁反应，旨在建立一种麦角硫因的高通量检测体系。同时以不同灵芝菌株EGT产量不同对该高通量检测体系进行验证。本研究结果将为高产EGT微生物的筛选及高产EGT新菌株的选育提供了新的方法和思路。

代表性结果

讨论与结论

根据麦角硫因具有强还原性的理化性质，在构建出EGT-硫氰酸铁体系之前，还先后实验构建碱性高锰酸钾体系、溴甲酚绿体系、蓝瓶子亚甲基蓝体系、愈创木酚体系、氯化铁-EGT体系，结果表明：碱性高锰酸钾体系因为稳定性低失败；溴甲酚绿体系显色结果因为与pH有关失败；蓝瓶子亚甲基蓝体系中，由于还原态亚甲基蓝的还原性太强，与空气中的氧气接触也极易被氧化成亚甲基蓝，导致实验无现象而失败；愈创木酚体系同样因为还原性太强受氧气接触干扰而失败；氯化铁体系因为显色程度太低而失败。EGT-硫氰酸铁体系可以用于EGT高通量检测方法的研究。

EGT-硫氰酸铁检测体系构建过程中发现，待测样品按照普通EGT粗提方法即醇沉-氮吹-定容提取时，提取液中残留的酚类物质会影响体系的显色反应，降低体系的灵敏度，因此粗提液在氮吹定容后，需增加氯仿除酚步骤。

灵芝是我国传统名贵的药用真菌，含有多种生物活性物质和生理功能，其麦角硫因含量在众多食用菌中含量较高，但是作为商业化生产的菌株其产量还偏低，因此培育高产麦角硫因的灵芝新菌株具有重要的意义及实际应用价值，基于以上原因，本实验室通过原生质体融合再生，分离鉴定得到一批拟融合子，本方法验证过程使用的灵芝融合子，均来源于此。

本研究建立的方法基于EGT本身理化性质，检测体系灵敏稳定，适用于产EGT工业发酵菌株选育过程中，大批量样本的快速比较，且理论上只需经过简单的样品EGT提取优化，即可适用于绝大部分菌株EGT含量的高通量快速检测，打破了原有EGT研究检测的局限性，为EGT的整体开发应用研究提供了新的方法和思路。该研究成果发表在《天然产物研究与开发》2022年第1期，欢迎引用(点击左下方“阅读原文”可查看全文)。

引用格式：

徐晴元,游俊健,林俊芳,等.灵芝麦角硫因高通量检测方法研究[J].天然产物研究与开发,2022,34:114-120. Xu QY,You JJ,Lin JF,et al.A high-throughput detection method of ergothione in Ganoderma spp.[J].Nat Prod Res Dev,2022,34:114-120.