植物吲哚乙酸(IAA)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

植物吲哚乙酸(IAA)ELISA试剂盒用于体外定量检测组织、细胞及相关液体样本中植物吲哚乙酸（IAA）的含量。

实验原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被植物吲哚乙酸（IAA）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的植物吲哚乙酸（IAA）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

植物吲哚乙酸(IAA)ELISA试剂盒

样本处理及要求

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

操作步骤

1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

3. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

4. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

5. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于硼对根瘤菌胞外多糖和吲哚乙酸分泌的调控研究

以不同硼浓度（0（ck）、0.05、1、5、10和100 mg/L）处理根瘤菌Ensifer meliloti LZgn5f（gn5f）（内源根瘤菌,来源于供试材料）和Ensifer meliloti 12531f（12531f）（外源根瘤菌）,筛选适宜硼浓度,并用此浓度处理两菌株,研究硼对两根瘤菌产胞外多糖、IAA以及菌体形态结构的影响。

采用蛋白组学方法研究硼处理两根瘤菌蛋白表达差异变化,进一步阐明硼对根瘤菌胞外多糖及IAA分泌的调控机制。取得结果如下:1.添加100 mg/L硼有利于gn5f生长,1 mg/L硼有利于12531f生长;此外,100 mg/L硼处理根瘤菌gn5f、1 mg/L硼处理根瘤菌12531f,均可促进二者胞外多糖和IAA分泌量,改变根瘤菌菌体形态及表面结构。

2. 蛋白组学分析,100 mg/L硼处理根瘤菌gn5f,有7个蛋白表达上调,47个蛋白表达下调。功能分类将这些蛋白分为细胞过程（运输和分解代谢）、环境信息处理（膜运输）、遗传信息处理（转录）、代谢（全局和概览通路）以及其他未知功能蛋白5类,其中已知功能的上调蛋白NAD依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、乙酰辅酶A合成酶和琥珀酸半醛脱氢酶[NADP（+）])均属于代谢（全局和概览通路）类功能蛋白。1 mg/L硼处理根瘤菌12531f,有3个蛋白表达上调,4个蛋白表达下调,它们可分为细胞过程（运输和分解代谢）、遗传信息处理（转录）、代谢（全局和概览通路）和其他未知功能蛋白4类,其中上调蛋白Uvr ABC系统蛋白B属于遗传信息处理（转录）类功能蛋白,天冬氨酸裂氨酶和CTP合酶属于代谢（全局和概览通路）类功能蛋白。

3. 根据差异蛋白表达富集的主要代谢通路分析,100 mg/L硼促进根瘤菌gn5f产胞外多糖和IAA的机制为:硼通过促进NAD依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、乙酰辅酶A合成酶、琥珀酸半醛脱氢酶[NADP（+）]等差异蛋白上调,继而促进丙酮酸代谢、GABA旁路代谢,谷氨酸代谢等与三羧酸循环有关的代谢通路,为胞外多糖合成提供能量及所需要的各种糖类物质（D-半乳糖残基,D-葡萄糖残基以及D-葡萄糖醛酸等）,继而促进胞外多糖的合成;硼促进色氨酸的合成,然后色氨酸在相关酶的作用下经吲哚-3-乙酰胺（IAM）或吲哚-3-丙酮酸途径合成IAA,继而促进IAA的合成。

1 mg/L硼促进根瘤菌12531f产胞外多糖和IAA的机制为:硼通过促进天冬氨酸裂氨酶和CTP合酶蛋白表达上调,促进三羧酸循环的中间产物延胡索酸的生成,继而促进三羧酸循环中某些代谢通路,合成胞外多糖的中间产物（单糖的重复单元）并且提供能量,单糖重复单元在非糖类残基（乙酰基、丙酮基和琥珀酰基等）修饰下合成胞外多糖。二氢硫辛酰胺脱氢酶蛋白表达下调抑制了吲哚-3-丙酮酸途径,间接促进了吲哚-3-乙酰胺（IAM）的形成,继而促进IAM转化成IAA。

参考文献

[1]Influence of boric acid on energy metabolism and stress tolerance of Candida albicans[J].Martin Schmidt,Dominic Tran-Nguyen,Patrick Chizek.Journal of Trace Elements in Medicine and Biology.2018

[2]Dual Role for DsbA in Attacking and Targeted Bacterial Cells during Type VI Secretion System-Mediated Competition[J].Giuseppina Mariano,Laura Monlezun,Sarah J.Coulthurst.Cell Reports.2018(3)

[3]Effectiveness of 3 per cent boric acid in 70 per cent alcohol versus 1 per cent clotrimazole solution in otomycosis patients:a randomised,controlled trial[J].S Romsaithong,K Tomanakan,W Tangsawad,S Thanaviratananich.The Journal of Laryngology&Otology.2016(9)

[4]Theoretical study on the chemical mechanism of enoyl-CoA hydratase and the form of inhibitor binding[J].Xiaobin Cui,Rongxing He,Qinlei Yang,Wei Shen,Ming Li.Journal of Molecular Modeling.2014(9)

[5]陈永岗.硼对根瘤菌胞外多糖和吲哚乙酸分泌的调控研究[D].甘肃农业大学,2020.