双缩脲法蛋白含量测定试剂盒的应用

背景^[1-3]

双缩脲法蛋白含量测定试剂盒可测各种动物血清（浆）、组织等样本中蛋白含量。蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一.它以Lambert-Beer定律为原理，即在一定浓度和波长范围内溶液吸光度值与其浓度呈线性关系。本试剂盒能够微量快速地进行蛋白质测定，操作简便，快速省时，可节省大量试剂，并能一次测定大量样品。

测定原理：强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物；紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。该方法测定范围为1~10mg蛋白质，适用于蛋白质浓度高的样品，尤其是动物材料。

材料与试剂

双缩脲试剂：称取1.50g五水硫酸铜和6.0g酒石酸钾钠(四水)，用500ml左右的蒸馏水溶解，在搅拌下加入300ml10%氢氧化钠溶液，定容至1L,储存于塑料瓶中。可长期使用。若出现黑点或红色沉淀时，则不能再用。加入0.1%KI可防止铜的析出。

1%标准酪蛋白溶液：用0.05M氢氧化钠溶液配制，酪蛋白的纯度可用微量凯氏定氮法。

试管、分光光度计。

双缩脲法蛋白含量测定试剂盒

操作过程

1、标准曲线的制作：于试管中分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml的1%标准酪蛋白溶液，用水补足1ml。然后各加入4ml双缩脲试剂，充分摇匀在室温下反应30min，于540nm波长下测定光吸收率。以酪蛋白的含量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

2、样品测定

取样品溶液1ml加入4ml双缩脲试剂，摇匀后在室温下反应30min，测定光吸收值，从标准曲线查出蛋白质含量。

应用^[4][5]

用于蛋白质健康标志物准确定量方法研究

通过对参考方法中各参数进行校准、建立计量溯源性来保证参考方法被准确、严格的执行。在实验过程中,按照参考方法对各参数的要求,使用滤光片标准物质（GBW（E）130225、GBW（E）130226）逐一对实验中使用的紫外-可见分光光度计波长、吸光度进行校准,使用纯水称重法对移液器进行校准;使用蛋白标准品牛血清白蛋白（SRM927）作为血清总蛋白含量溯源依据,以蛋白标准物质牛血清白蛋白（BW3627-1）和冻干人血清白蛋白（GBW09187）作为样品,对双缩脲法的准确性、重复性、再现性、检出限、定量限等方法学数据进行了评价,从而建立准确可靠的血清总蛋白定量方法。

并对国际参考实验室室间质量评价活动（RELA）的国际对比血清样品A、B进行了定量测定和不确定度评价。国际比对反馈的结果表明,我们的结果和其它实验室具有很好的一致性,表明了测定方法的准确以及测定技术的可靠性。其次,针对由无需考虑活性的单一蛋白健康标志物的准确定量问题,以血清中人心脂肪酸结合蛋白（H-FABP）测定为例,采用同位素稀释质谱法进行准确定量。

心肌脂肪酸结合蛋白作为心肌损伤标志物的一种,对其进行准确定量对于心血管疾病诊断治疗具有重要意义。采用质量平衡法和同位素稀释质谱法对心肌脂肪酸结合蛋白进行了纯品含量测定,测定结果分别为0.795 g/g和0.781 g/g,并对同位素稀释质谱方法的准确性、重复性、不确定度等方法学参数进行了评价。最后,建立了血清中心肌脂肪酸结合蛋白的同位素稀释质谱测定方法,测定结果为2.56 ng/g,与ELISA试剂盒的测定结果2.34 ng/g具有良好的一致性,同时对该方法的准确性、重复性、加标回收率、检出限以及定量限进行了评价。

心肌脂肪酸结合蛋白纯品同位素稀释质谱方法以及血清中心肌脂肪酸结合蛋白同位素稀释质谱方法都可以溯源到SI单位,可以作为心肌脂肪酸结合蛋白纯品标准物质、血清中心肌脂肪酸结合蛋白标准物质的测定方法,对于心肌脂肪酸结合蛋白的测定准确性、互通性具有重要意义。

最后,针对活性靶标蛋白定量问题,以大豆转基因G2蛋白为例,采用PCR蛋白定量方法进行定量。现今大部分蛋白质的检测方法都需要标准品做标准曲线来进行相对定量,因而无法对活性靶标蛋白进行准确的绝对定量。利用抗原抗体的特异性结合来捕捉活性靶标蛋白质,再利用数字PCR仪作为测定仪器,就可以实现对蛋白质活性靶标蛋白浓度的绝对定量。

基于以上设想,在荧光PCR以及数字PCR上进行了蛋白质的相对定量实验以保证绝对定量方法的可行性。本文使用大豆转基因G2蛋白以及G2蛋白的两个不同结合位点的单抗mbA1、mbA2为基础,使用TaqMan蛋白系列试剂盒成功地建立了荧光PCR G2蛋白定量方法以及数字PCR G2蛋白定量方法。

并使用G2蛋白标准物质为检测样品,对两种方法的准确性、重复性、再现性、检出限以及定量限进行了评价。并把两种方法的方法学参数和所建立的ELISA法的方法学参数进行了对比,结果表明PCR蛋白定量方法具有较高的准确性和重复性。

同时,数字PCRG2蛋白定量方法由于其使用仪器为数字PCR,其结果的准确性和稳定性要比荧光PCR G2蛋白定量法的结果好。另外,由于数字PCR仪能直接给出样品的拷贝数而不依赖于标准曲线,所以对数字PCR蛋白定量方法进行了G2蛋白活性靶标蛋白浓度的绝对定量探究。

参考文献

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[5]郑康乐.蛋白质健康标志物准确定量方法研究[D].北京化工大学,2018.