植物染色质免疫沉淀分析(CHIP)试剂盒的应用

背景^[1-3]

植物染色质免疫沉淀分析(CHIP)试剂盒可以有效进行体外检测植物中蛋白质-DNA相互作用，操作方便.操作过程不到六小时就可以获得比其它试剂盒更好的结果.试剂盒获得的染色质可用来进行定性和定量PCR、southern印迹以及DNA微阵列分析。

植物染色质免疫沉淀分析(CHIP)试剂盒提供了对植物细胞样品进行染色质免疫沉淀反应所需的所有试剂。并且，试剂盒中还有一种ChIP级二甲基组蛋白H3-K9抗体和一种阴性对照抗体（正常小鼠的IgG）。从细胞样品中提取出来的染色质进行适当的打断，然后加入到微孔中与其表面上吸附的抗体发生免疫反应。特异性结合到微孔上的DNA从抗体-捕获蛋白-DNA复合物上释放出来，翻转后，通过纯化.洗脱下来的DNA可用于随后的各种分析。

质免疫沉淀分析染色图

操作流程：

染色质免疫沉淀技术的原理及一般操作流程为：

1.在活细胞状态下，使用交联剂（常为甲醛）将蛋白质-DNA复合物固定下来；

2.然后通过理化方法（常为酶消化法或者超声破碎）将这种复合物中的DNA随机切割为一定长度范围内的染色质小片段；

3.继续使用蛋白质A的特异性抗体I（一般要求ChIP级别）处理，将含有蛋白质A的蛋白质-DNA片段特异性标记；

4.再利用一种可以结合抗体的Protein A（一般偶联到分选柱和磁珠上，便于分离），将含有抗体的复合物从作用体系中富集分离出来，未被抗体标记的蛋白质-DNA则被洗脱去除；

5.将得到的抗体-蛋白质-DNA复合物解交联，纯化富集其中的DNA片段；

6.利用针对目的基因B转录调控区的特异性引物（一般设计多个位点，覆盖多个区域）进行PCR（以前多为半定量PCR，现在随着设备的升级，使用荧光定量PCR也逐渐普及）等手段检测，如果其中有PCR检出阳性则表明蛋白质A可以与基因B的转录调控区有结合（可以是直接也可以是间接结合，具体区分还需要进行进一步的EMSA检测），而具体的结合位点就在引物覆盖区域及其周边位置。

应用^[4][5]

用于葡萄转录因子VlbZIP30抗旱功能及其调控机理研究

从葡萄品种（Vitis labruscana:V.labrusca×V.vinifera）‘巨峰’（Kyoho）中克隆到VlbZIP30,并通过遗传转化模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）和‘无核白’（Thompson Seedless）葡萄,研究了VlbZIP30对干旱胁迫响应的功能及其调控机制。

获得如下主要研究结果:1、属于A亚家族的VlbZIP30受ABA和干旱胁迫诱导表达。VlbZIP30开放阅读框全长978bp,编码325个氨基酸。氨基酸序列分析表明其含有一个基本的亮氨酸拉链结构域和4个磷酸化位点（C1、C2、C3和C4）。系统进化树分析表明,VlbZIP30与A亚家族的ABF/DPBF亲缘关系最近。从‘巨峰’葡萄基因组DNA中克隆了VlbZIP30长度为2000bp的启动子序列,并构建了含有GUS报告基因的植物表达载体,转化到拟南芥后发现在种子、幼苗、花序、茎、毛状体、花和长角果中均检测到GUS活性,且GUS的活性受到ABA或甘露醇处理诱导增强。另外,ABA和脱水处理可诱导葡萄叶片VlbZIP30上调表达,这些结果暗示着VlbZIP30参与葡萄响应干旱胁迫。

2、VlbZIP30可能通过调控干旱胁迫相关基因的表达来增强拟南芥的干旱胁迫抗性。过表达VlbZIP30显著增强了拟南芥在幼苗期和成龄苗期对渗透胁迫和干旱胁迫的抗性。转录组分析显示,在ABA或甘露醇处理下,幼苗期拟南芥中大部分ABA信号基因和干旱响应基因受VlbZIP30转录调控。从转基因植物中上调的39个拟南芥基因和对应的35个葡萄同源基因的启动子中分别鉴定到一个拟南芥G-box元件（CACGTG）和一个潜在的葡萄G-box元件（MCACGTGK）。随后,利用两个葡萄相关的数据库数据,发现在检测到的葡萄基因中有74%（23/31）和84%（21/25）的基因分别被ABA或干旱胁迫显著诱导表达,表明这些基因可能与ABA或干旱胁迫有关,并且在葡萄中可能受VlbZIP30调控。

3、VlbZIP30通过激活木质素生物合成基因的表达并增加木质素沉积以及激活干旱胁迫基因的表达来共同促进葡萄抗旱性的增强。在对照条件下,过表达VlbZIP30的转基因葡萄植株在茎的表皮和次生木质部表现出木质素的显著沉积（主要是G型和S型木质素）。

研究发现,这是由于VlbZIP30调控木质素生物合成基因VvPRX4和VvPRX72的表达上调所致。同时还发现,在干旱条件下,VlbZIP30的过表达显著增强葡萄的抗旱性,具体表现为转基因植株叶片的失水率降低,保持了有效的光合速率,以及增加木质素的积累（主要是G型木质素）。EMSA、双荧光素酶活性分析和染色质免疫沉淀（ChIP）-q PCR实验结果表明,VlbZIP30可以直接特异性结合木质素生物合成基因（VvPRX N1）和干旱响应基因（VvNAC17）启动子上的G-box顺式作用元件,以激活其表达,最终赋予转基因葡萄的抗旱性。

4、利用RNA-seq和ChIP-seq关联分析,系统解析VlbZIP30基因参与调控葡萄抗旱性的调控机制。通过ChIP-seq分析,在全基因组范围内鉴定VlbZIP30直接结合的靶基因。ChIP-seq结果表明,VlbZIP30与包含ACGTG（G-box）的DNA序列结合。

结合ChIP-seq和RNA-seq数据结果,研究鉴定到VlbZIP30可能诱导的48个靶基因。通过ChIP-q PCR分析,证实了VlbZIP30直接与启动子中包含G-box元件的四个靶基因（VvNAC26、VvDHN1、VvGRAS17和VvVQ6）结合。此外,在干旱条件下,无论是拟南芥还是葡萄,过表达VlbZIP30的转基因植株中积累的H2O2均比野生型植株少。研究发现VlbZIP30可以通过调节下游靶基因的表达来增强植物体内ROS的清除活性,从而提高葡萄的抗旱性。

参考文献

[1]The transcription factor VaNAC17 from grapevine（Vitis amurensis）enhances drought tolerance by modulating jasmonic acid biosynthesis in transgenic Arabidopsis.[J].Su Lingye,Fang Linchuan,Zhu Zhenfei,Zhang Langlang,Sun Xiaoming,Wang Yi,Wang Qingfeng,Li Shaohua,Xin Haiping.Plant cell reports.2020(5)

[2]VvNAC17,a novel stress-responsive grapevine（Vitis vinifera L.）NAC transcription factor,increases sensitivity to abscisic acid and enhances salinity,freezing,and drought tolerance in transgenic Arabidopsis[J].Yan-lun Ju,Xiao-feng Yue,Zhuo Min,Xian-hang Wang,Yu-lin Fang,Jun-xiang Zhang.Plant Physiology and Biochemistry.2020(C)

[3]A Molecular Blueprint of Lignin Repression[J].Marc Behr,Gea Guerriero,Jacqueline Grima-Pettenati,Marie Baucher.Trends in Plant Science.2019(11)

[4]Genome-wide identification of the LEA protein gene family in grapevine（Vitis vinifera L）[J].Mohammed?brahime,Umut Kibar,Kemal Kazan,Canan Yüksel?zmen,Filiz Mutaf,Sinem Demirel,Birsen akr Aydemir,Ali Ergül.Tree Genetics&Genomes.2019(4)

[5]涂明星.葡萄转录因子VlbZIP30抗旱功能及其调控机理研究[D].西北农林科技大学,2021.