小鼠Ⅰ型胶原C端肽(CTX-Ⅰ)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

小鼠Ⅰ型胶原C端肽(CTX-Ⅰ)ELISA KIT用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中小鼠Ⅰ型胶原C端肽(CTX-Ⅰ)的含量及活性。

样本处理及要求：

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

小鼠Ⅰ型胶原C端肽(CTX-Ⅰ)ELISA KIT

操作步骤

1. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品zui终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

2. .温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

3. .配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

4. .洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

5. .加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

6. .温育：操作同3。

7.洗涤：操作同5。

8.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

9.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

10.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于探讨骨代谢标志物与肾性骨营养不良的相关性研究

比较肾功能正常组及慢性肾脏病患者的骨代谢标志物:骨钙素（OC）、I型前胶原N末端前肽（PINP）及Ⅰ型胶原羧基端肽β特殊序列（β-CTX）的特点,分析慢性肾脏病患者的骨钙素、PINP、β-CTX与甲状旁腺激素（i PTH）、血钙（Ca）、血磷（P）之间的相关性。

探讨骨代谢标志物与肾性骨营养不良的相关性,以期能够早诊断肾性骨营养不良。

方法:收集慢性肾脏病患者及肾功能正常患者共208例患者作为研究对象,其中慢性肾脏病患者180例,肾功能正常患者28例,收集两组患者性别、年龄、体重、身高、体重指数（BMI）等一般临床资料,收集血肌酐（Cr）、肾小球滤过率（e GFR）、骨钙素、PINP、β-CTX、血钙、血磷、甲状旁腺激素（i PTH）等生化指标,以及患者是否透析、是否使用骨病相关药物等资料,比较肾功能正常组及慢性肾脏病组的上述数据进行统计学分析,并将慢性肾脏病3期、4期及5期患者的骨钙素、PINP、β-CTX分别与i PTH、血钙、血磷进行相关性分析。

结果:1.肾功能正常组与慢性肾脏病患者在血肌酐、e GFR、OC、β-CTX、PINP、血钙、血磷之间的差异具有明显统计学意义（P<0.05）,且CKD组的骨钙素、β-CTX、PINP、i PTH均显著高于非CKD组（P<0.05）;

2. 慢性肾脏病组患者不同性别之间的血肌酐、肾小球滤过率、骨钙素、β-CTX、PINP、血钙、血磷指标差异无统计学意义（P>0.05）;

3. CKD组患者骨代谢标志物相关性分析:CKD4期组患者骨钙素与i PTH的Spearman相关系数rs=0.683,（P<0.05）,CKD5期组患者骨钙素与i PTH的Spearman相关系数rs=0.353,（P<0.001）,CKD5期组患者β-CTX与i PTH的Spearman相关系数rs=0.545,（P<0.001）,CKD5期组患者PINP与i PTH的Spearman相关系数rs=0.280,（P<0.05）,CKD5期组患者骨钙素与血磷的Spearman相关系数rs=0.170,（P<0.05）;

4. 随着CKD的进展,骨钙素在CKD3b期出现升高趋势,β-CTX在CKD3b期出现升高趋势,PINP在CKD4期出现升高趋势,i PTH在CKD5期出现升高趋势,血钙在CKD5期出现下降趋势,血磷CKD4期出现升高趋势。

结论:1.骨代谢标志物在慢性肾脏病组相较于肾功能正常组之间有明显升高;

2. 慢性肾脏病组患者不同性别之间血肌酐、肾小球滤过率、骨钙素、β-CTX、PINP、血钙、血磷指标无明显差异;

3. 慢性肾脏病4期患者骨钙素与i PTH呈正相关,慢性肾脏病5期组患者骨代谢标志物（骨钙素、β-CTX、PINP）与i PTH呈正相关关系,其中β-CTX与i PTH的相关性最高,骨钙素与血磷呈正相关;

4.慢性肾脏病组患者随着病情进展,骨代谢标志物的变化相对早于血钙、血磷及i PTH。提示骨代谢标志物有望可以用于肾性骨营养不良的早期诊断及评估肾性骨营养不良的严重程度。

参考文献

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[2]A dual-label time-resolved fluorescence immunoassay for screening of osteoporosis based on simultaneous detection of C-terminal telopeptide（β-CTX）and aminoterminal propeptide（P1NP）of type I procollagen[J].Xu Yichun,Wang Qiyou,Hou Gang,Yao Hui,Zhao Huiqing.Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation.2019(1-2)

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[4]Effect of Cinacalcet Combined with Calcitriol on the Clinical Outcome and Bone Metabolism in Patients on Hemodialysis with Severe Secondary Hyperparathyroidism.[J].Yuan Fang,Chen Xing,Wang Chang,Li Zheng,Liu Hong.Blood purification.2018(1-3)

[5]解其敏.探讨骨代谢标志物与肾性骨营养不良的相关性[D].重庆医科大学,2021.