大鼠甲状旁腺激素(PTH) ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

大鼠甲状旁腺激素(PTH)ELISA KIT用于测定血清、血浆、组织及相关液体样本中甲状旁腺激素(PTH)的含量或活性。

实验原理：

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中甲状旁腺激素(PTH)水平。用纯化的甲状旁腺激素(PTH)捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入甲状旁腺激素(PTH)，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的甲状旁腺激素(PTH)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中甲状旁腺激素(PTH)含量。

大鼠甲状旁腺激素(PTH)ELISA KIT

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

应用^[4][5]

用于去卵巢和雌激素预防性给药对大鼠甲状旁腺激素基因的表达调控研究

采用双侧卵巢切除术建立绝经后骨质疏松（postmenopausal osteoporosis,PMOP）大鼠模型,利用石蜡组织切片和HE染色对大鼠的股骨、胫骨、子宫、十二指肠、肾皮质和肾髓质进行组织形态学观察,利用酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测血清中雌激素的变化,用实时定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time qPCR）技术检测SD大鼠甲状旁腺中PTH、雌激素受体（estrogen receptor,ER）表达变化。进一步对调控PTH表达的潜在通路中的关键基因,如钙敏感受体（calcium sensing receptor,CaSR）、维生素D受体（vitamin D receptor,VDR）、成纤维细胞生长因子-23（fibroblast growth factor-23,FGF-23）、FGF-23的受体1（fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1）、FGF-23的辅助受体Klotho和早期生长反应基因1（early growth response gene 1,Egr1）的表达量进行分析,探讨去卵巢和预防性给药对PTH的调控机制。

脏器和骨组织形态学观察结果表明,去卵巢（ovariectomized,OVX）组大鼠的股骨和胫骨均出现骨小梁断裂、间距变大、结构紊乱等骨质疏松症状,而去卵巢后预防性注射β-雌二醇（β-estradiol-treated OVX,OVX/E2）组并未出现明显的病理症状。相较于假手术（Sham-operated,Sham）组,OVX组和OVX/E2组的十二指肠、肾皮质和肾髓质区都未出现明显病变。相较于Sham组,OVX组大鼠子宫内膜固有层中的子宫腺数目增多、腺腔增大、子宫黏膜上皮明显增厚。OVX/E2组的子宫腺腺腔虽略有增大,但腺体形态较为规则,其子宫内膜也未发生明显的增厚现象。说明注射小剂量的β-雌二醇可以预防骨质疏松症的发生,且不会有子宫癌变的现象发生。ELISA检测结果表明三种不同处理组间大鼠的血清雌激素没有显著性的差异。Real-time qPCR检测结果表明,去卵巢后大鼠PTH的表达量显著下调,而预防性注射β-雌二醇后PTH的表达量显著上调。

ER-α存在于甲状旁腺中,且去卵巢后ER-α的表达量上调,而预防性注射β-雌二醇后ER-α的表达量显著下调,说明甲状旁腺中ER-α能够响应雌激素的微弱变化,参与PTH的表达调控。去卵巢后大鼠甲状旁腺中VDR的表达量上调,而预防性注射β-雌二醇后大鼠甲状旁腺中VDR的表达量下调,表明VDR可能是抑制PTH的表达。

去卵巢后血清中Ca2+略有升高,甲状旁腺中CaSR的表达量显著下调,预防性注射β-雌二醇后Ca2+略有升高,甲状旁腺中CaSR的表达量显著上调,表明Ca2+/CaSR调控系统可能参与PTH的表达调控。去卵巢后大鼠甲状旁腺中FGF-23、FGFR1、Klotho及Egr1表达量显著下调,而预防性注射β-雌二醇后FGF-23、Klotho和Egr1的表达量下调,FGFR1的表达量显著上调,说明去卵巢后甲状旁腺中FGF-23/Klotho系统对PTH表达的抑制作用降低了,但是预防性注射β-雌二醇后这个受体系统的功能更低。

这些结果表明,去卵巢和预防性给药可能会影响甲状旁腺中ER-α、VDR信号调控系统、Ca2+/CaSR调控系统以及FGF-23/Klotho受体调控系统,进而调控PTH的表达。

参考文献

[1]Gata3 cooperates with Gcm2 and MafB to activate parathyroid hormone gene expression by interacting with SP1[J].Song-iee Han,Yukino Tsunekage,Kohsuke Kataoka.Molecular and Cellular Endocrinology.2015

[2]The calcium sensing receptor life cycle:Trafficking,cell surface expression,and degradation[J].Gerda E.Breitwieser.Best Practice&Research Clinical Endocrinology&Metabolism.2013(3)

[3]Evidence of a Functional Estrogen Receptor in Parathyroid Adenomas[J].Felix Haglund,Ran Ma,Mikael Huss,Luqman Sulaiman,Ming Lu,Inga-Lena Nilsson,Anders H??g,C.Christofer Juhlin,Johan Hartman,Catharina Larsson.The Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism.2012(12)

[4]Primary hyperparathyroidism in children and adolescents[J].Jeffrey Roizen,Michael A.Levine.Journal of the Chinese Medical Association.2012(9)

[5]张婷婷.去卵巢和雌激素预防性给药对大鼠甲状旁腺激素基因的表达调控研究[D].陕西理工大学,2017.