SDS-PAGE凝胶制备试剂盒的应用

背景^[1-3]

SDS-PAGE凝胶制备试剂盒包括SDS-PAGE凝胶制备所需全套试剂，只需自备纯水，即可制备高质量各种浓度的变性PAGE凝胶，方便、快捷。

蛋白电泳经常使用聚丙烯酰胺凝胶来实现蛋白分离，此类凝胶一般由浓缩胶和分离胶两部分组成，前者起到将蛋白样品进行浓缩的作用，后者则是根据凝胶所使用的丙烯酰胺单体和N,N-亚甲基双丙烯酰胺（甲叉丙烯酰胺）交联剂的浓度不同从而分离不同大小范围的蛋白质。

SDS-PAGE凝胶制备试剂盒

操作步骤：

根据目的蛋白分子量大小选择合适的PAGE分离胶配制浓度

1. 参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。

注：加入上层筛板有助于加样时保持填料与样品均匀接触，是否加入上层筛板可根据实际情况选择。

2.将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、SDS-PAGE Separating Gel Buffer、SDS Buffer和纯水在小烧杯或试管中混合。

3.加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。

4.在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1 cm的水层，使凝胶表面保持平整。

5.静置30-60分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，表面凝胶已聚合。

II灌制浓缩胶

1.去除覆盖在分离胶上的水层。

2.将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、SDS-PAGE Stacking Gel Buffer、SDS Buffer和纯水在一个小烧杯或试管中混合。

3.加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。

4.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。

5.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。

6.静置10~20分钟，等待浓缩胶聚合。

7.待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。

8.进行常规电泳操作。

应用^[4][5]

用于鸡β-防御素-13成熟肽cDNA的克隆及在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达研究

研究主要针对鸡Gal-13成熟肽的基因进行了克隆,通过构建Gal-13成熟肽cDNA序列的原核表达载体和真核表达载体,实现其在大肠杆菌BL21和毕赤酵母X-33中的表达,为进一步研究Gal-13的生物活性和其在畜牧业中的生产应用奠定了基础。

1. Gal-13基因序列的扩增及其在大肠杆菌中的诱导表达Gal-13cDNA的全场基因序列为312bp,编码的Gal-13共包括60个氨基酸,其中,信号肽序列为前20个氨基酸,前导肽序列为4个氨基酸,成熟肽序列包括36个氨基酸。

依据NCBI中公布的Gal-13（登陆编号：DQ858323）基因序列并借助Primer5软件设计引物,以三黄鸡的肝脏总RNA为模板,通过RT-PCR技术扩增Gal-13的全长cDNA序列,将测序结果经Blast比对后,借助MEGA软件,采用Neighbor-Joining法,与其相关序列进行比对分析并构建系统进化发育树。

序列经鉴定分析后设计引物,扩增Gal-13成熟肽,并在序列中引入限制性内切酶BamHI和XhoI的酶切位点,将所得序列与表达载体pGEX-4T-1经双酶切后构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Gal-13,并将重组质粒转化到大肠杆菌BL21进行诱导表达,结果显示Gal-13成熟肽在大肠杆菌中得到大量表达,且诱导表达时间为5h,诱导剂的浓度为0.2 mmol/L,SDS-PAGE和Western-blot检测结果显示,表达的含有GST标签的重组蛋白分子量大小约为30ku,表明Gal-13成熟肽序列在大肠杆菌中得到了成功表达,但主要以包涵体的形式存在,存在于上清中的可溶性目的蛋白较少。

Gal-13成熟肽基因序列在毕赤酵母中的诱导表达依据Gal-13基因序列重新设计引物,并在其中引入限制性内切酶EcoRⅠ和KpnⅠ的酶切位点,扩增Gal-13成熟肽基因序列后进行双酶切,将其插入到酵母分泌表达载体pPICZαA中,,构建重组表达质粒pPICZαA-Gal-13,将鉴定正确的重组质粒,用限制性内梅SacⅠ进行线性化处理后,电击转化毕赤酵母X-33,并利用甲醇对阳性重组菌株进行诱导表达,诱导表达上清用Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳进行鉴定。

结果显示,Gal-13成熟肽基因序列成功插入到表达质粒pPICZaA中且重组质粒成功转化了毕赤酵母X-33,经过鉴定分析,获得了表型为Mut+的高抗性重组菌株,在甲醇的诱导下,Gal-13成熟肽在菌液上清中得到了表达,Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,重组菌株在诱导72h时,Gal-13在上清中得到大量的表达,在5.9ku的位置出现了目的蛋白条带,与预期结果一致,抑菌试验表明,Gal-13对鸡沙门氏菌（CVCC534）和金黄色葡萄球菌（ATCC25923）均具有一定的抑制作用。

参考文献

[1]Molecular cloning and expression analysis of twoβ-defensin genes in the blunt snout bream（Megalobrama amblycephala）[J].Tao Liang,Dan-Dan Wang,Gui-Rong Zhang,Kai-Jian Wei,Wei-Min Wang,Gui-Wei Zou.Comparative Biochemistry and Physiology,Part B.2013(1)

[2]Expression of avianβ-defensins and Toll-like receptor genes in the rooster epididymis during growth and Salmonella infection[J].M.Anastasiadou,M.Avdi,G.Michailidis.Animal Reproduction Science.2013(3-4)

[3]Identification of three novel avian beta-defensins from goose and their significance in the pathogenesis of Salmonella[J].Deying Ma,Mingyue Zhang,Kexin Zhang,Xiaoli Liu,Zongxi Han,Yuhao Shao,Shengwang Liu.Molecular Immunology.2013(4)

[4]A note on the organization and expression ofβ-defensin genes in Polish goats[J].E.Bagnicka,B.Prusak,E.Ko?ciuczuk,J.Jarczak,J.Kaba,N.Strza?kowska,A.Jó?wik,M.Czopowicz,J.Krzy?ewski,L.Zwierzchowski.Journal of Applied Genetics.2013(1)

[5]许国洋.鸡β-防御素-13成熟肽cDNA的克隆及在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达[D].四川农业大学,2014.