人增殖细胞核抗原(PCNA)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人增殖细胞核抗原(PCNA)ELISA试剂盒用于血清、血浆、细胞培养上清液和其它生物体液内人增殖细胞核抗原(PCNA)含量检测。

试剂盒性能

1.灵敏度：最小的PCNA检测浓度小于15mU/ml。

2.特异性：可同时检测重组或天然的人PCNA。不与人其它细胞因子有交叉反应。

3.重复性：板内、板见变异系数均小于10％。

人增殖细胞核抗原(PCNA)ELISA试剂盒

实验原理

人增殖细胞核抗原(PCNA)ELISA试剂盒采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗人PCNA单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的PCNA与单抗结合，加入生物素化的抗人PCNA，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，PCNA浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中PCNA浓度。

准备试剂与收集血样

1.收集标本：血清、血浆（EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存，避免反复冻融。

2.标准品液配制：使用前加入1ml蒸馏水混匀，配成20000mU/ml的溶液。设标准管8管，管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在管中加入20000mU/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。

3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。

4.洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）

检测程序

1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。

2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

3.每孔中加入抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。

4.洗板：同前。

5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。

6.洗板：同前。

7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。

8.每孔加入100ul终止液混匀。

9.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

结果计算与判断

1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。

2.以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0 mU/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应PCNA含量即可。

应用^[4][5]

用于增殖细胞核抗原和肿瘤增殖标记分子在胃癌中的表达及临床意义研究

PCNA是一种36KD的酸性核蛋白,在静止细胞内几乎不表达,仅在具有分裂能力的细胞中阶段性表达。PCNA能辅助DNA聚合酶δ合成DNA,参与损伤DNA的修复合成,并且对细胞周期的调控具有一定的作用。Ki-67是另一种细胞增殖蛋白,与细胞的增殖密切相关,可以被当做识别正常细胞与肿瘤细胞的标志物,在周期性增殖细胞中表达。

Ki-67在细胞分裂周期中阶段性表达,参与细胞周期的调控,与DNA、核糖体、核仁的合成密切相关。PCNA、Ki-67为细胞分裂周期中重要组成蛋白,对细胞周期的调控及促进起到积极作用。

近年来研究表明,这两种蛋白能有效的反映细胞分裂状态,已广泛应用于肿瘤的良恶性诊断、评估肿瘤的发生、发展及预后等方面。目前对于胃癌诊断及预后评估的研究诸见报端,但是,经查证尚未有学者对胃癌组织进行PCNA和Ki-67联合检测的报道。

实验采用免疫组化SP方法,分别检测胃癌组织、癌前病变组织及正常胃组织中PCNA、Ki-67的表达情况,探讨两者与胃癌发生发展的联系及其影响机制,以及两者与CEA在胃癌中的相关性分析;同时探讨两者与胃癌细胞分化等级、浸润深度、淋巴结转移、肿瘤部位、临床分期等临床特征的关系。

方法:随机选取根治性手术的胃癌患者87例,所有患者均按照NCCN胃癌临床实践指南的标准诊断。患者术后癌组织及正常胃组织标本保存完好,住院病历资料及检验、病理资料完整可查。同时随机选取同期在西南医科大学附属医院内镜医学部行胃镜检查并经病理组织活检诊断为胃癌前病变的病理组织标本35例,所有患者经胃镜检查并经病理组织检查确诊为慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生或上皮内瘤变。

通过免疫组织化学SP方法检测PCNA、Ki-67在胃癌组织、胃癌前病变组织及正常胃组织中的表达情况。同时查阅胃癌患者检验资料,了解患者术前血清CEA表达情况。

实验所得数据采用SPSS19.0进行统计运算,计量资料采用t检验,计数资料采用卡方检验,应用Spearman进行相关性分析;MedCalc作ROC曲线分析特异度。结果:胃癌组织中,77例为PCNA阳性表达,10例为阴性表达,阳性率为88.51%;87例正常胃组织中,3例呈阳性表达,84例阴性表达,阳性表达率为3.45%;35例胃癌前病变组织切片中,17例呈阳性表达,18例为阴性表达,阳性率为48.57%;胃癌组织较胃癌前病变、正常胃组织中PCNA的表达具有显著性差异（χ2=22.509、126.705 P<0.001）,胃癌前病变组织中PCNA较正常胃组织具有显著性差异（χ2=37.078 P<0.001）。

胃癌组织中PCNA的表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、分化等级等临床特征无显著性相关（χ2=0.302、1.049、0.302、0.019 P=0.583、0.306、0.583、0.889）;与肿瘤淋巴结转移、浸润深度、TNM分期显著性相关（χ2=9.621、7.206、12.978 P=0.007、0.002、<0.001）。

参考文献

[1]Cancer statistics in China,2015[J].Wanqing Chen,Rongshou Zheng,Peter D.Baade,Siwei Zhang,Hongmei Zeng,Freddie Bray,Ahmedin Jemal,Xue Qin Yu,Jie He.CA:A Cancer Journal for Clinicians.2016(2)

[2]Cancer incidence and mortality worldwide:Sources,methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J].Jacques Ferlay,Isabelle Soerjomataram,Rajesh Dikshit,Sultan Eser,Colin Mathers,Marise Rebelo,Donald Maxwell Parkin,David Forman,Freddie Bray.Int.J.Cancer.2015(5)

[3]Global cancer statistics,2012[J].Lindsey A.Torre,Freddie Bray,Rebecca L.Siegel,Jacques Ferlay,Joannie Lortet‐Tieulent,Ahmedin Jemal.CA:A Cancer Journal for Clinicians.2015(2)

[4]PCNA,the Maestro of the Replication Fork[J].George-Lucian Moldovan,Boris Pfander,Stefan Jentsch.Cell.2007(4)

[5]李敏.增殖细胞核抗原和肿瘤增殖标记分子在胃癌中的表达及临床意义[D].西南医科大学,2019.