质粒小量提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

质粒小量提取试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，根据离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的原理特异性提取质粒DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA，可限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。质粒小量提取试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。

每个质粒纯化柱可以结合的质粒量的上限大于500微克。每个纯化柱可用于抽提100毫升左右用LB培养过夜的大肠杆菌。抽提所得质粒的OD260和OD280比值一般在1.80左右。抽提获得的质粒量会受质粒拷贝数等因素影响。抽提获得的质粒DNA的OD260和OD280比值也会因菌种不同等原因而略有波动。

使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（将试剂盒中提供的RNaseA全部加入），混匀，置于2-8℃保存。如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

质粒小量提取试剂盒适用于常用的EndA-菌株DH5A、JM109和XL-1 blue等。对于EndA+菌株如JM110、BL21(DE3)、TG1和HB101等，可以顺利完成质粒抽提，但从EndA+菌株中抽提获得的质粒会有轻微的核酸酶污染，如果在内切酶缓冲液中37℃孵育1小时会导致质粒全部降解。

质粒小量提取试剂盒

提取步骤:

1用1.5 ml离心管收集1-5 ml菌液。12,000 rpm离心1min，弃上清。

2加入250μl溶液Ⅰ/RNase A混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。室温静置1-2min。

3加入250μl溶液Ⅱ，轻柔地反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2 min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。

4加入350μl溶液Ⅲ，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。此时会出现白色絮状沉淀。

5 12,000 rpm室温离心10 min，收集上清。

6将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2 min。

7 12,000 rpm离心1 min，弃滤液。

8加入500μl溶液PB，12,000 rpm离心1 min，弃滤液。

9加入500μl溶液W，12,000 rpm离心1 min，弃滤液。

10加入500μl溶液W，12,000 rpm离心1 min，弃滤液。

11 12,000 rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。

12将DNA纯化柱置于新的离心管中。向纯化柱中央处，悬空滴加50-100μl溶液Eluent，室温放置2 min。12,000 rpm离心1 min，管底即为高纯度质粒DNA。质粒DNA于-20℃保存

应用^[4][5]

用于人源性肝细胞系的构建研究

正常人肝组织和培养人肝细胞是理想的BAL细胞源和体外药物代谢模型，但由于全世界范围内的供肝短缺以及原代培养时存活时间短和难以传代等缺点，使得利用正常人肝脏分离肝细胞来作为BAL的细胞源显得非常困难。胎肝细胞尤其是从较大月龄胎肝分离到的肝细胞，虽能在体外继续分化增殖，且免疫原性弱，较少引起异种蛋白反应，但同样受制于来源问题和伦理学原因，使得难以在临床推广应用。为此有学者试度采用永生化肝细胞来克服这些不足，如C3A、HepG2、CL—1等细胞系。在美国采用C3A和HepG2细胞构建EBLSS治疗FHF动物和少量临床试验已获肯定结果，其中以C3A细胞构建的EBLSS已被批准进行二期临床试验。但上述细胞系均来源于肿瘤细胞，研究显示无论在P450活性、氨清除功能以及尿素合成等方面均不如猪肝细胞，加之以肿瘤源性肝细胞作为治疗工具，用于处于免疫抑制状态下的FHF患者，尤其是将接受肝脏移植、需终生使用免疫抑制剂的患者身上，总觉令人担忧。

实验采用脂质体转染法，将猿猴病毒40大T抗原（SV40LTag）基因转染至来源于正常成人原位肝移植的供肝细胞，建立一永生化肝细胞系。

新型人源性肝细胞系的构廷材料和方法SV40 DNA（strain 776）、质体转染试剂盒、IV型胶原酶、hepatoZYME－SFM培养基、DMEM培养基、G418等购自美国Invitrogen公司；真核表达载体pCDNA3．1（－）为本研究所保存载体；胎牛血清BS)购自美国Hyclone公司；PCR产物纯化试剂盒。凝胶电泳切胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒等购自美国QIAGEN公司；限制性内切酶BamH、限制性内切酶BstXl、T4连接酶、DNA Marker等购自美国Promega公司；DHS u大肠杆菌山本实验室提供。

实验所需主要试仪器设备有：PCR扩增仪、蛋白核酸测定仪、纯水仪、低温高速离心机、水平电泳仪、低温冰箱，凝胶电泳成相系统、自行设计的体外灌流装置。成人肝细胞来自一位O型血、年龄25岁的健康男性原位肝移植供肝。

采用PCR方法，以SV40全序列DNA为模板，扩增SV40LTag DNA；T4 DNA连接酶连接经BamH酶切SV40LT8g DNA牙pcDNA3．1（构建SV40LTag—pCDNA3．1）重组载体并转化至DHS Q大肠杆菌感受态细胞，通过BStX酶切鉴定和DNA序列测定以确定重组载体；最后利用脂质体转染法将SVp0LTag—pCDNA3．1（－）重组载体转染至正常成人肝细胞，经G418筛选，直至获得阳性克隆细胞并观察转染细胞的形态特征。

参考文献

[1]Bioengineering of liver assist devices[J].Arno W.Tilles,Fran?ois Berthiaume,Martin L.Yarmush,Ronald G.Tompkins,Mehmet Toner.Journal of Hepato-Biliary-Pancreatic Surgery.2002(6)

[2]Auxiliary Liver Transplantation and Bioartificial BridgingProcedures in Treatment of Acute Liver Failure[J].Karim Boudjema,Philippe Bachellier,Philippe Wolf,Jean-Daniel Tempé,Daniel Jaeck.World Journal of Surgery.2002(2)

[3]Bioartificial Liver Support Anno 2001[J].Robert A.F.M.Chamuleau.Metabolic Brain Disease.2002(4)

[4]In-vitro uptake of radioactive lipiodol I-131 and I-125 by hepatoblastoma:implications for targeted radiotherapy[J].E.Towu,G.Boxer,R.Begent,J.Zweit,L.Spitz,K.Hobbs,M.Winslet.Pediatric Surgery International.2001(8)

[5]李君.人源性肝细胞系的构建[D].浙江大学,2003.