蛋白酶体抑制剂亚基PI31抗体的应用

背景^[1-3]

蛋白酶体抑制剂亚基PI31抗体是一类可以特异性结合蛋白酶体抑制剂亚基PI31的多克隆抗体，主要用于体外检测蛋白酶体抑制剂亚基PI31的免疫学实验。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)包括脂类激酶家族，它们能够催化磷酸酯转移至肌醇脂类的D-3'位置，从而产生磷脂酰肌醇-3-磷酸(PIP)、磷脂酰肌醇-3，4-二磷酸(PIP2)和磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(png，然后它们通过含有血小板-白细胞C激酶底物同系、FYVE、Phox及其它磷脂-结合域的停靠蛋白在信号级联中作为第二信使，进入通常位于桨膜的各种信号复合体中。

蛋白酶体抑制剂亚基PI31抗体

在两禾中1类PI3Ks中，1A类PI3Ks是由具有催化性的pllO亚基(a、13、S同种型)组成的杂二聚体，所述亚基在结构上与调节亚基(可以是p85a、p55a、p50a、p85P或p55Y)有关。IB类具有一个家族成员，它是由具有催化性的pllOY亚基组成的杂二聚体，该亚基与两个调节亚基(pl01或p84)之一有关。

p85/55/50亚基的调节域包括Src同源性(SH2)域，它与激活的受体和细胞质酪氨酸激酶上特殊序列中的磷酸酪氨酸残基结合，导致1A类PI3Ks的激活和定位。IB类PI3K被可以与肽和非肽配体的不同组成部分结合的G蛋白-偶联受体直接激活，因此，得到的I类PI3K的磷脂产物使上游受体与下游细胞活性联系起来，所述活性包括增殖、存活、趋化性、细胞运输(cellulartrafficking)、运动性、代谢、炎性和过敏反应、转录以及翻译。

在细胞内，每时每刻都会合成大量新的蛋白质，也有大量旧的蛋白质会被降解。为了维持细胞的正常工作，蛋白质水平的动态稳定至关重要。在细胞内，大部分蛋白是由泛素-蛋白酶体系统降解的——细胞如果觉得一个蛋白已经失去了作用，就会给它打上泛素的“标签”。这就好像是快递单一样，把蛋白送往蛋白酶体这个“垃圾处理厂”。在那里，蛋白质会被降解成多肽，供细胞重复利用。

多发性骨髓瘤是蛋白酶体抑制剂可以大展身手的疾病领域。人们发现多发性骨髓瘤细胞对蛋白酶体的活性有很高的依赖性——这些细胞会产生大量异常蛋白，为细胞带来了巨大的压力。因此，多发性骨髓瘤细胞会开足蛋白酶体工厂的马力，清除体内的异常蛋白。如果抑制蛋白酶体的功能，就会让癌细胞不堪重负，最终崩溃和死亡。

应用^[4][5]

用于睾丸蛋白酶体的鉴定及其功能研究

在纯化牛肌肉、睾丸和脾脏中的蛋白酶体时发现,从这三种组织来源的蛋白酶体在从阴离子交换柱上洗脱的时候所需的离子强度不同。利用短肽荧光底物对从牛肌肉、睾丸和脾脏中纯化的26S蛋白酶体进行酶活性分析的时候发现,我们初步发现,从牛睾丸中纯化出的蛋白酶体的chymotrypsin like活性要显著低于从牛肌肉和脾脏中纯化出的蛋白酶体的活性（P<0.05）,睾丸蛋白酶体的trypsin like活性显著高于肌肉和脾脏中的蛋白酶体的活性（P<0.05）,而肌肉蛋白酶体的caspase like活性要显著高于睾丸和脾脏蛋白酶体的活性（P<0.05）。

但是应用两种蛋白质底物Histone H1和Casein来测定这三种组织来源的蛋白酶体的降解活性却未发现存在着何种差异（P>0.05）。在应用针对蛋白酶体三种活性位点的抑制剂（MG132、Velcade、Leupeptin和Ac-ApnLD-Al）对肌肉和睾丸组织来源的蛋白酶体进行活性抑制时也未发现对这两种蛋白酶体的抑制效应存在差异（P>0.05）。

在应用体外培养的生精细胞系和体细胞系进行实时定量PCR实验和Western blot实验时发现,在所选的细胞系中都存在着表达水平类似的PSMB5基因,但是在培养的精原细胞株和精母细胞株（GC-1spg和GC-2spd）中存在着较高水平的PSMB8基因的表达,而在其他两种体细胞株（NIH 3T3和C2C12）中却并未发现这种基因的表达。

应用PSME4的抗体在精母细胞系GC-2spd中进行免疫沉淀实验来确认同PSME4结合的20S蛋白酶体类型时我们发现,蛋白酶体的催化亚基中PSMB8、PSMB9、PSMB6和PSMB7都可以同PSME4共沉淀下来,而蛋白酶体的组成亚基PSMB5和在IFN-γ诱导下产生的亚基PSMB10都不能同PSME4共沉淀,提示由这两种催化亚基参与所构成的20S蛋白酶体可能不与PSME4发生结合。

而应用PSME4的抗体在体细胞系NIH 3T3中进行免疫沉淀实验时却并未沉淀下来蛋白酶体的催化亚基,提示在体细胞中虽然也存在着PSME4的表达,但是可能并不参与组成蛋白酶体。应用原位杂交技术观察了小鼠睾丸组织切片中PSME4、PSMB8和PSMB5在生精细胞不同发育阶段中的表达情况。

发现PSME4、PSMB8和PSMB5的基因表达水平随生精细胞处于不同的发育阶段而存在着差异,以生精细胞发生周期中的Ⅷ期为转折点,在此期之前,PSME4、PSMB8和PSMB5在圆形精子中的表达呈现阳性反应,而粗线期精母细胞（Pachytene spermatocyte）中的表达为阴性反应；Ⅷ期之后,这三种基因在粗线期精母细胞中的表达转为阳性反应,而在圆形精子和细线期精母细胞（Leptotene spermatocyte）中的表达为阴性,此外这三种基因在各期的Sertoli细胞和长形精子细胞中的表达呈现阴性反应。

参考文献

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[2]IRF-1 mediates upregulation of LMP7 by IFN-γand concerted expression of immunosubunits of the proteasome[J].Shin Namiki,Tetsuya Nakamura,Shigeru Oshima,Motomi Yamazaki,Yuko Sekine,Kiichiro Tsuchiya,Ryuichi Okamoto,Takanori Kanai,Mamoru Watanabe.FEBS Letters.2005(13)

[3]Large‐and Small‐Scale Purification of Mammalian 26S Proteasomes[J].Yuko Hirano,Shigeo Murata,Keiji Tanaka.Methods in Enzymology.2005

[4]Monitoring Activity and Inhibition of 26S Proteasomes with Fluorogenic Peptide Substrates[J].Alexei F.Kisselev,Alfred L.Goldberg.Methods in Enzymology.2005

[5]杜伯雨.睾丸蛋白酶体的鉴定及其功能研究[D].中国协和医科大学,2008.