黑曲霉的应用

背景^[1][2]

黑曲霉属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科，是丝状真菌的一个常见种，广泛分布于粮食、植物产品和土壤中。人类运用黑曲霉的历史悠久，早在中国古 代，人们就利用黑曲霉制作酱料、酱油、米酒等。由于黑曲霉生长旺盛、发酵周期短、不产生毒素，被美国 FDA认证为安全菌种。黑曲霉具有很强的外源基因表达能力及高效的蛋表达、分泌和修饰能力，同时重组子具有很高的遗传稳定性。

随着越来越多的外源蛋白在黑曲霉成功表达，且被证明具有较高的产量和活性，黑曲霉成为了一个重要的酶表达体系，也逐渐成为重要的工业酶制剂生产菌种。据报道，黑曲霉可生产纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、果胶酶、脂肪酶。黑曲霉生产的工业酶在淀粉加工、发酵、酿造、饮料生产动物饲料和造纸行业等领域发挥了巨大的作用。

此外，黑曲霉还可以作为异源蛋白的生产宿主及生产柠檬酸和葡萄糖酸的细胞工厂，因其具有高产、高分泌、高安全性等优点而被广泛地应用于发酵工业中。黑曲霉基因组序列和注释信息的公布，大大推进了后续的各种组学研究，使人们能够更加深入分析这一重要黑色真菌的代谢潜力，以及应用现代生物技术进一步提高它的生产能力。

基因组学^[2]

黑曲霉基因组序列的发表为其他组学的研究和生物技术的应用提供了新的平台。新一代测序技术 (Next Generation Sequencing，NGS)为快速获得多种基因组序列提供了高效的工具，为基因组和转录组测序和分析带来了革命性的突破。目前，已经有 4 株黑曲霉完成了全基因组测序：分别为野生型菌株 ATCC9029 和高产柠檬酸菌株 ATCC 1015，经过传统诱变方法得到的高产酶菌株 CBS 513.88，以及无孢子型糖化酶工业菌株 SH2。

转录组学^[2]

全转录组层次的数据分析可以使研究者更加精确地评估细胞表型与基因表达的关系，加深对细胞代谢的理解。随着测序技术的发展，近年来越来越多转录组研究采用新一代的高通量转录组测序技术 (RNA sequencing，RNA-seq)。相比于基因芯片，RNA-Seq 技术能够获得新转录本，可变剪切等更多的基因结构和功能信息，提高测序结果的准确性。测序技术的日益进步推动了转录组学的发展及其在代谢工程领域的应用。

蛋白质组学^[2]

黑曲霉组学研究进展黑曲霉中蛋白的生产和分泌是一个十分复杂的过程，且同源和异源蛋白的产量差异很大，同源蛋白的产量是异源蛋白产量的 10−100倍。说明真菌在表达和分泌异源蛋白过程中遇到瓶颈。为从全局水平研究外源蛋白在黑曲霉中表达和分泌受限的机制，需要借助现代组学技术研究环境、基因表达调控与蛋白合成及转运之间的复杂关系。真菌蛋白质组学技术的发展，为工业菌种改造和改进工业发酵过程提供新的途径。

代谢物组学^[2]

代谢物组定义为一个生物体或一群细胞在特定时空条件下所有代谢物的集合，这些代谢物是与生物体生理表型相关度最高的一个组学层次。可靠的胞内代谢物组数据的获取和代谢通量分析是揭示细胞真实代谢状态的直接证据，对于提高代谢工程和工业发酵过程优化的理论和实践水平也具有重要意义。

有实验通过研究黑曲霉产酶突变株GAM15 和模式株 CBS 513.88 在氧限制的条件下发酵生理参数和代谢流分布的差异，确定了黑曲霉生产糖化酶过程中的一些限制性因素。对副产物的分析发现，突变株的副产物 (草酸和柠檬酸) 积累量远远小于野生株。此外，还发现草酸的形成与菌体的比生长速率具有协同关系，因此进入氧限制条件后，草酸的合成速率降低使得更多的碳流流向糖化酶合成，这也成为氧限制条件下糖化酶产量提高的重要原因。

基于本实验室构建的黑曲霉中心碳代谢网络，利用代谢流平衡分析 (Flux balance analysis，FBA) 计算胞内代谢通量分布。结果表明，核糖和还原力是限制菌体生长的主要因素。在氧限制阶段，糖化酶前体氨基酸的供给成为合成糖化酶主要的限制性因素，因此可通过改造氨基酸合成相关的基因提高氨基酸的合成，从而加速糖化酶的合成并提高底物利用效率。

应用^[3][1]

黑曲霉是重要的工业生产菌，广泛应用于酶、抗生素、有机酸等物质的生产。

1. 黑曲霉产纤维素酶。

黑曲霉是产纤维素酶产量最高的菌株之一，目前国内外基于黑曲霉发酵产纤维素酶的研究也较为集中。为提高纤维素酶酶解秸秆产 糖效果，以碱性双氧水处理过的玉米秸秆为发酵基质，通过里氏木霉与黑曲霉混合发酵，获得产酶条件。结果发现，滤纸酶活力可达1.224，较优，β -BG可达0.315 IU/mL。通过单因素实验及均匀设计法实验研究了黑曲霉 C112发酵产β -BG的条件，所得酶活力可达 12.925IU/mL，较优化前提高了79％。

2. 黑曲霉产木聚糖酶。

木聚糖酶的工业化始于1980年左右，最初应用于饲料工业，饲料中添加木聚糖酶系可使植物性饲料更加容易被消化吸收。后来又扩展到食品、纺织和造纸等工业。木聚糖酶作为重要的酶制剂在市场上的份额占总销售额 的10％。黑曲霉是发酵产木聚糖酶的菌种之一，目前国内外有很多关于提高黑曲霉产木聚糖酶表达的最新研究。对黑曲霉孢子进行热击处理，探讨了热击处理促进孢子萌发和木聚糖酶活力的机制。

结果表明，42℃下热击4h后转入29℃发酵，可促使黑曲霉孢子较早萌发和菌丝较快生长。其中，发酵24h的菌丝干重提高了38.5％，发酵72h时达到生物量，较未处理的提前了12h。热击处理后的发酵产酶总量和单位质量菌丝产酶量均高于恒温发酵，热击处理对木聚糖酶的种类并没有影响。

3. 黑曲霉产蛋白酶。

白酶是水解肽键的一类酶的总称。按照水解方式的不同，蛋白酶可以分为内肽酶和外肽酶两种。内肽酶主要以蛋白质分子链中间的肽键为作用位点，可以把蛋白质分子切断成为较短的肽链；外肽酶主要从蛋白质分子的末端氨基或羧基进行逐个切割。蛋白酶主要应用在医药、食品、皮革纺织后 加工等领域。

工业上主要的蛋白酶制剂生产菌株为枯草杆菌、栖土曲霉等。黑曲霉以其食品卫生认可和可观的蛋白酶表达量，也日益成为另一个重要的蛋白酶发酵菌株。国内外的研究主要集中在发酵培养基的组成方面.以泸型大曲中分离的黑曲霉为菌种，采用固态发酵产酸性蛋白酶，酸性白酶活力达 24350U/g，平均酶活比初始培养基提高了64.6％。

4. 黑曲霉产淀粉酶。

淀粉酶是水解淀粉等葡萄糖大分子聚合物的酶类总称，一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖原等。根据产物异构类型的不同，可分为α－淀粉酶与β－淀粉酶等。其中，微生物分泌表达的淀粉酶一般是指α－淀粉酶。淀粉酶在淀粉加工中发挥重要作用，它可以将微生物难以利用的大分子转化为低聚糖、麦芽糖、麦芽三糖、葡萄糖等小分子，加速生物转化过程。

因此，耐酸淀粉酶、耐高温淀粉酶成了目前发酵原料处理方面的研究热点。黑曲霉作为传统的产淀粉酶菌株之一，文献报道较多。对一株高产蛋白酶和淀粉酶的黑曲霉菌株 A020进行研究，确定该菌株的产酶培养基为：香蕉皮基础培养基中添加1％ 蛋白胨、1％ 麦芽糖和3*10³mol/L氯化钠，酶活比优化前提高了68.2％。黑曲霉产脂肪酶。

脂肪酶是以酯键为催化位点的一类酶，由一个可打开和关闭的“ 盖子” 结构作为催化中心，分为亲水和疏水两种构象，具有多项催化反应（如催化解脂、酯交换、酯合成等）能力，因而成为重要的工业酶制剂品种之一，广泛应用于油脂加工、食品、日化等领域。脂肪酶基因作为外源基因在宿主中表达已成为可靠的技术，在细菌、酵母和丝状真菌都已经实现量产。黑曲霉由于其食品安全性，在食品用脂肪酶的生产上有较多的研究。

5. 其他。

黑曲霉不仅在传统酶制剂的发酵生产上具有优势，在其它新酶的生产方面也具有非常广阔的应用前景。黑曲霉在众多微生物表达系统中凸显出优势，主要有以下几个原因：首先，作为真核生物，黑曲霉细胞内拥有内质网、高尔基体等蛋白后加工模块及复杂的基因排列方式、内含子等原核生物没有的特征，这些特征使黑曲霉表达体系可以生产一些结构较为复杂的蛋白质或酶。

许多工业酶、食品酶、医药类酶的结构趋于复杂，是原核生物表达系统（如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等）无法完善表达的，这使得黑曲霉在结构较复杂的酶种表达领域具有广阔前景。其次，黑曲霉表达体系不但拥有优秀的蛋白后加工能力，而且秉承了大部分好氧微生物生长快速、代谢旺盛、生存力强的优势，这使得黑曲霉表达体系产出的蛋白和酶质量高、产量大。

黑曲霉可适应26-37℃的生长温度，耐ｐＨ值范围达2.5-6.5，有类似低等植物的生长方式，菌丝发达且分枝多，也有类似酵母菌的孢子生殖方式，分生孢子梗由特化了的厚壁从膨大的菌丝上生出。另外，黑曲霉基因组中具有众多强启动子。有无强启动子是微生物表达体系能否作为外源蛋白表达工具的重要参考。黑曲霉糖化酶启动子为黑曲霉中运用最广泛的一个诱导型启动子，许多已经工业化的菌株都以它为启动子，并经过基因改造用来生产酶制剂。

与此同时，黑曲霉还具有美国FDA认证的食品级生产许可，这是许多其它整合表达系统（如毕赤酵母表达系统等） 所不具备的，这也为黑曲霉在食品领域的应用提供了质量保障。

主要参考资料

[1] 黑曲霉发酵产酶研究进展

[2] 黑曲霉组学研究进展

[3] 王宝石. 黑曲霉发酵生产柠檬酸的关键节点解析及对策[D]. 江南大学, 2017.