核糖核酸的制备方法

背景及概述^[1]

核糖核酸是动物体内一种生物大分子，是一种重要的免疫触发剂或免疫调节剂。1967年通过肉瘤免疫绵羊制取的淋巴细胞核糖核酸对大鼠进行试验，发现核糖核酸能抑制荷瘤鼠肿瘤的生长，甚至消除，首次证实了免疫核糖核酸能传递免疫信息。1982年林单坤等人把从免疫羊肝中提取得到的核糖核酸做成制剂注入体内，发现对肿瘤与癌症有明显的疗效并能提高机体的免疫功能，而且未出现不良的副作用。从脾脏中提取得到的免疫核糖核直接制成针注入体内，可激活人体的T细胞及B细胞的活性；同时有提高人体免疫功能的作用，对一些与人体免疫功能下降有关的疾病，如慢性支气管炎、哮喘病、慢性乙型肝等，以及胃癌、乳腺癌、大肠癌等恶性肿瘤有显著的疗效。

制备^[1]

制备核糖核酸

一、配制溶液

(1)提取缓冲液(0.02M Tris-乙酸缓冲液)

900ml纯化水，加2.42克Tris，用乙酸调pH5.0，定容至1000ml。

(2)饱和酚液体

将苯酚在50℃融化，加入等体积提取缓冲液，搅拌均匀制成饱和酚溶液，避光保存。

(3)助沉淀缓冲液

3M乙酸钠溶液，pH5.0

(4)溶解缓冲液

1M NaCl溶于0.05M Tris-HCl缓冲液中，pH9.5。

二、提取过程

1、原材料选择和预处理

取小牛(1岁半以下)胰腺50公斤在25℃左右去筋膜、脂肪及结缔组织等非胰腺组织，用纯化水清洗干净，切成3～5cm小块。

2、组织及细胞的破碎

用干净绞肉机将胰腺小块绞碎，将绞碎的小牛胰腺移入胶体磨中，加入等量提取缓冲液，次以200μm破碎研磨，第二次以50μ研磨，真空下，研磨液应较易通过200目不锈钢网，得到100kg左右的匀浆液。

3、有效成份提取

匀浆液加入1倍体积饱和酚液体的上层水相，加入0.5倍体积饱和酚液体的下层酚相，加热到60℃，恒温120分钟，迅速冷却，在4～10℃离心(4000g，30分钟)，收集上清液，弃去沉淀(回收苯酚)。

上清液加入0.6倍体积氯仿-异戊醇(体积比24∶1)，摇匀15分钟，在4～10℃离心(4000g，30分钟)，收集上层的上清液，弃去中间层沉淀，回收底层氯仿层。

上清液加入0.3倍体积氯仿-异戊醇(体积比24∶1)，摇匀15分钟，在4～10℃离心4000g，30分钟)，收集含核糖核酸的上层上清液，弃去中间层沉淀，回收底层氯仿层。

上清液加入1倍体积助沉淀缓冲液，再加入2倍体积乙醇(95％)，摇匀，4℃放置过夜，在4～10℃离心(4000g，30分钟)，收集核糖核酸沉淀，上层的上清液为乙醇，回收乙醇。

为了能进一步提高核糖核酸的纯度，减少杂质含量，核糖核酸沉淀以溶解缓冲液溶解，加入乙醇至终浓度75％(质量)，在4～10℃下离心(4000g，30分钟)。

用75％乙醇反复洗涤沉淀2次，在4～10℃离心(4000g，30分钟)，收集核糖核酸沉淀，置50℃水中放置到无醇味(约1小时)。

以上过程提取过程可在16～18时间内完成，核糖核酸的提取率为3.8g/kg胰脏，较已有的核糖核酸提取工艺大大缩短了提取时间，产量提高1～2倍。在核糖核酸提取过程中，总会带有少量DNA杂质，由于DNA分子一般均比较大，注射时会间接引起过敏反应。本发明由于核糖核酸提取效率的提高，核糖核酸产品中RNA含量在99.7％左右，纯度0D260/0D280＞1.9，相比现有技术所提取得到的产品(RNA含量为95-96％)，产品纯度有了很大的提高，脱氧核糖核酸“污染”含量降低，能提高产品安全性；并且，提取过程批成品率提高30％左右，批报废率由30％降低到零，成本降低70％左右。

参考文献

[1] [中国发明,中国发明授权] CN200710099981.X 核糖核酸及其制备方法与应用